Immuno-PET在程序性细胞死亡受体配体-1活体成像中的研究进展

肖庆澳，夏 旋

三峡大学医学院生理与病理生理系，湖北 宜昌443002

免疫正电子发射型断层扫描仪（Immuno-PET）是一种将单克隆抗体（Mab）靶向特异性与PET技术高度敏感性融为一体的新型分子成像技术。这种技术不仅能识别与量化肿瘤细胞的靶点表达、了解全身免疫细胞的数量与分布、分子生物标志物的改变以及炎症反应进程［1］，还可对体内免疫药物的分布与代谢进行动态分析［2-3］。作为肿瘤标志物，程序性细胞死亡受体配体（PD-L1）是当前肿瘤免疫治疗的热点，各种单克隆抗体（如纳武单抗、派姆单抗、Avelumab）开始应用到临床［4-6］。越来越多的研究显示PD-L1的体内表达水平会影响免疫疗法疗效，因此了解PD-L1体内表达对免疫治疗方案的制定具有重要意义。传统“活检方式+免疫组化”不能对其表达进行实时动态评估，因此需要一种高特异性和灵敏度的方法对其表达进行定位、定量分析。本文就近年来Immuno-PET在活体表征肿瘤中PD-L1的研究进展作一综述。

1 Immuno-PET简介

自上世纪70年代PET进入临床应用以来，经过30多年的发展其在临床成像与诊断上的应用已非常广泛。20世纪80年代开始，相应临床研究表明使用放射性标记的Mab可以对肿瘤进行分子成像。但随着18F-脱氧葡萄糖正电子发射断层显像（18F-FDG PET）的应用，有限的诊断准确率使得抗体分子成像使用受限。虽然当时仍有少数研究人员尝试将其应用于特异性显像并取得了一些成就，但受制于当时探测器和处理软件的限制，并没有得到广泛的应用［8］。近10年来，得益于免疫靶点研究的深入，多种抗体（如：抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、抗PD-L1 和抗PD-1）研发为Immuno-PET的广泛使用奠定了基础，同时晶体探测器、扫描系统、抗体工程技术和核素合成技术的发展，也使得利用示踪剂抗体进行放射标记成像逐渐成为主流［8-9］。

Immuno-PET 作为一种新技术，其原理在于：将Mab用正电子核素（如68Ga、89Zr、124I等）标记并通过静脉入血，由血液循环将Mab带到肿瘤组织并与表面抗原相结合，或者提前注入特异性Mab，再注射被核素标记的能识别Mab的小分子使正电子核素在特定器官或组织中蓄积；利用放射性同位素不稳定易放出正电子的特性，通过晶体探测器可检测出同位素正电子与组织负电子堙灭过程中产生的粒子（如γ射线粒子）；由于正电子在组织中穿行距离仅仅只有几毫米，并受组织密度和初始能量影响，因此PET扫描系统扫描到粒子后，通过计算飞行时间就可以精确定位体内肿瘤的产生部位；在获得大量基本数据后通过计算机系统进行图像重建可得出患者的PET图像［7,10］。

2 Immuno-PET活体表征PD-L1的应用价值

PD-L1与细胞程序性死亡受体（PD-1）结合会抑制活化的T细胞，抑制免疫系统的抗肿瘤功能。通过抑制PD-1/PD-L1通路可解除对抗肿瘤T细胞的抑制，从而达到治疗肿瘤的目的［11］。研究显示PD-L1存在于各种类型的肿瘤组织中，包括黑色素瘤、多发性骨髓瘤、白血病、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌等［11］。此外，PD-L1的高表达也与肿瘤患者的不良预后密切相关。因此测定肿瘤细胞PD-L1表达水平可作为免疫治疗的评价标准。研究显示，对PD-L1阳性肿瘤患者使用药物抑制PD-1/PD-L1通路后，有效率可达90%以上［12-13］。值得注意的是，约10%免疫组化PD-L1 阴性患者对于PD-1/PD-L1通路治疗反应良好［14-15］。这可能是PD-L1的肿瘤异质性与抽样误差所致。

传统“活检方式+免疫组化”受制于PD-L1动态表达与异质性，不能及时准确表现体内分布状况；此外，活检取样只能得到一个病变的组织样本，不一定真实反映多个肿瘤或患者的免疫状态。PD-L1的表达也会随着疾病发展、免疫治疗、放化疗的进行而改变。通过多次活检了解体内PD-L1的动态变化也并不现实［2］。此外，据美国食品药品监督管理局报告显示，使用不同抗体与检测方法所得出的免疫组化结果之间也存在差异［16］。相比于免疫组化，使用核素标记PD-L1抗体进行PET成像更具优势［17-19］，既避免多次活检所造成的损伤，也能精确动态反映体内PD-L1的表达状况。对于原发性与转移性肿瘤均可通过非侵袭的方式进行相应评估。

在免疫药物靶向治疗方面，现有技术（如质谱分析、细胞热位移测定、荧光各向异性成像）有助于表征药物在细胞与组织中的活性，但在实时量化多病灶与跨病灶的药物靶点应用有限［20］。而Immuno-PET却可以提供一种精确方法来量化多病灶中存在的药物靶点，解决目前面临的一些挑战［21］，同时其还可评估治疗期间不同剂量与预后时间对肿瘤表征PD-L1的影响，通过数学建模分析治疗抗体的有效剂量［20］。在评估免疫疗法预后效果方面，现有方法如18F-FDG PET虽也可预测与评估靶向治疗方案，但其部分参数（如最大标准摄取值SUVmax、平均标准摄取值SUVmean）与免疫治疗的临床效果之间并不一致［22-23］。对比18F-FDG PET（通过检测脱氧核糖代谢而了解肿瘤分布），Immuno-PET可直接通过监测靶向特定受体来提供肿瘤的生物标志物信息［24］。其对肿瘤的高度敏感性、高空间分辨率以及精确定量的能力可对临床治疗与组织摄取程度的关联进行精确评估［25-27］。

3 常用表征PD-L1正电子核素

目前PD-L1显像剂所用放射性核素主要有64Cu、68Ga、89Zr、124I。124I虽然也是选项之一，但其能量过大，在PET成像时会导致空间分辨率下降。其半衰期与新型放射性核素相比也过长（T½=4.2 d），同时其在体内的脱卤作用也使得其应用受限［28］。89Zr（T½=78.4 h）因其易制备、成本低与纯度高的特点自被应用之日起就受到广泛关注，在临床上具有广阔的应用前景。虽然Zr+在体内对骨组织具有高亲和力，可能会对各种骨骼疾病诊断带来干扰，但其复合物在骨组织的蓄积呈现低而稳定的状态，为其衍生复合物应用于成像提供了可能［29］。89Zr也易被生物细胞摄取，与传统抗体（如西妥昔单抗）结合后在某些癌症活体成像上表现较好［27］。此外，64Cu的化学配位研究已经基本成熟，许多高效螯合剂（如3p-CNE3TA、3p-C-NOTA与3p-C-DE4TA）被已被研发［30］。利用双螯合剂（如3p-C-NOTA）与64Cu形成的新化合物具有适宜半衰期与组织低排斥性的特点。这显示出64Cu在Immuno-PET应用中巨大的应用前景。近年来，随着单域抗体这类短半衰期的抗体与新型合成技术出现，18F的高正电子产率与短半衰期也使其逐渐应用于Immuno-PET相关研究中［17］。除此之外，68Ga、111In等正电子核素也逐渐在PD-L1 的追踪检测中发挥着重要作用［31］。

4 新型PD-L1示踪剂

在目前的实验中，示踪剂大多需要2～4 d获得高组织对比度的PET图像。这将会极大影响免疫治疗方案的制定。因此，如何获得更加高效的PD-L1探头也是Mab优化研究的热点之一（表1）。基于Immuno-PET显像原理，新型示踪剂必须在温和条件下高效、快速、特异性结合相应靶点，同时必须高特异性肿瘤摄取与低背景噪声。示踪剂需要尽可能快的达到特异性饱和，而未结合示踪剂需迅速从血液循环中清除［1］。目前常见Immuno-PET示踪剂类型包括IgG全长依赖型、Fab片段型、单域抗体、单链抗体与其它类型［1］。

4.1 全长IgG依赖型示踪剂

目前IgG制剂的相关研究最为广泛，其在肿瘤靶向治疗上具有重要意义。有学者开发出一种新型抗PDL1的IgG称为C4并利用去铁氧胺B（DFO）螯合剂将89Zr与C4连接成89Zr-C4［29］。在注入抗PD-1反应阳性的人源肿瘤组织来源移植瘤模型48 h后，89Zr-C4在肿瘤中的蓄积达到高峰且远高于血液与肌肉。这表明PD-1反应阳性患者可使用放射示踪剂对体内PD-L1成像。但IgG分子量（150 000）大于肾滤过最大分子量（60 000），无法通过肾脏排出因而易产生蓄积。此外，其Fc段与新生儿Fc受体相互作用也使其在血清中难以快速清除，这也导致最佳背景噪声比出现的时间点较长［1,7］。因此在使用前需要对其背景噪声进行相应研究。有学者利用89Zr制备不同IgG抗体示踪剂（如89Zr-antiCD20、89Zr-anti-EGFR）并结合Immuno-PET对抗体在人体非靶点表达组织内的非特异性蓄积与解离进行了量化并提供了基准曲线，为后续的相关研究提供了可能［32］；另有研究利用DIBO-DFO将抗PD-L1抗体与89Zr螯合生成89Zr-DFO-6E11，在对HCC827细胞与淋巴组织的显像中取得较好效果［33］。

表1 几种新型表征PD-L1的immuno-PET示踪剂性质Tab.1 Properties of several novel PD-L1tracers of immuno-PET(Mean±SD)

许多IgG抗体免疫治疗药物也开发出相应的显像剂［6］。Jagoda 等［34］使用89Zr 标记Avelumab（89Zr-DFOPD-L1 Mab）对PD-L1阳性人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）移植小鼠模型进行PET成像［34］。值得注意的是，该研究显示注射纯89Zr-DFO-PD-L1 Mab（2 μg）时，小鼠骨组织对89Zr-DFO-PD-L1 Mab摄取高于肿瘤组织，若混合40 μg 的PD-L1 Mab 则可显著增加肿瘤组织摄入89Zr-DFO-PD-L1 Mab；此外，Lesniak等［35］使用NSG小鼠（敲除Rag2 和IL-2Rγ，存在免疫缺陷）构建高表达PD-L1中国仓鼠卵巢细胞（CHO-hPD-L1）肿瘤模型，随后注射[64Cu]Atezolizumab进行成像。注射后24 h与48 h 肿瘤每克组织注射剂量百分比（%ID/g）分别为39.8±2.8与40.6±6.9，而同一时间点对照组（CHO）的%ID/g为11.1±1.9与10.1±3.3。此外，对照组与实验组小鼠其他器官和组织中的[64Cu]Atezolizumab无差异。这显示出[64Cu]Atezolizumab在表征活体PD-L1的特异性。此外，有研究通过89Zr-Atezolizumab对患有转移性膀胱癌、非小细胞肺癌以及三阴性乳房癌患者体内的PD-L1水平进行评估［36］。给予患者0.1～0.3 mg/kg剂量的89Zr-Atezolizumab便可用于PET成像，而这一剂量为推荐治疗剂量的1/100［36-37］。在进行免疫治疗后，相比于免疫组化与RNA测序预测标志物，患者免疫治疗的效果与Immuno-PET表征PD-L1结果相关性更好。遗憾的是，因为89Zr-Atezolizumab的清除率较低，最佳PET图像需要在数日后获得。

4.2 Fab片段示踪剂

与完整的抗体相比，抗体片段虽然潜在接合位点少［24］。但去除Fc部分可以降低显影剂的免疫原性，从而在生物体内的半衰期更短且在肿瘤实质中分布更加均匀。Fab在联合64Cu后也可以降低注射早期信背比［19,38］。基于Fab片段的PET显像剂非特异性累积少、清除更快，可提供更高的对比度成像［39］。有学者开发出一种新型Fab片段（αPD-L1），其利用1，4，7-三氮杂环壬烷N，N'，N''-三乙酸（NOTA）将αPD-L1与64Cu结合进而形成64Cu-NOTA-αPD-L1［40］。64Cu-NOTA-αPD-L1注入裸鼠静脉45 min后可获得最佳图像并发现棕色脂肪组织和脾脏呈现富集状态。而在注入64Cu-NOTA-αPDL1前，使用αPD-L1的Fab（200 μg）进行抑制处理后棕色脂肪组织与脾中NOTA螯合剂的富集情况消失，显示出64Cu-NOTA-αPD-L1在PET成像剂中的特异性与可靠性。

4.3 单域抗体示踪剂

单域抗体又称纳米抗体，是来源于骆驼与鲨鱼血清中的最小抗体绑定衍生物（15 000）［41］。其只包含抗体重链，体积只有正常抗体的1/10，具有非常适宜的物理化学性质，一直以来都被当做一种潜在的优质显像剂。有学者利用单域抗体与68Ga结合形成的68Ga-NOTANb109复合物进行成像实验，在A375-hPD-L1细胞组织中表现出高亲和力，而且这种亲和力不会随竞争性抑制剂（如KN035）的增加而减弱，提示该单域抗体的结合位点与PD-1不同［42］。68Ga-NOTA-Nb109的体内半衰期为47.79 min，在注射2 h后，90%以上的复合物都经过尿液以原型排除，肾脏对抗体的蓄积保持在较低状态，血管与肌肉中复合物含量也都显著下降。相较于IgG，单域抗体表现出强大的易排除特点。此外，KN035是我国自主研发的一种抗PD-L1单域抗体Fc融合蛋白，其采用IgG的Fc段融合单域抗体，从而获得对人PD-L1的高敏感性与特异性，对鼠PD-L1无交叉反应。Li等［16］基于KN035在肝脏具有较高的本底同位素摄取的特点，使用89Zr来降低本底信号。在对灵长类动物试验中利用流式细胞仪验证了其与89Zr结合生成的89Zr-Df-KN035对于A375细胞的高度敏感性，以高效液相色谱法对89Zr-Df-KN035的标记效率进行检测发现标记效率超过70%。

4.4 高特异性肽段示踪剂

WL12是一种由14个氨基酸组成的环状肽，与PDL1 具有较高的亲和力［43］。Chatterjee 等［44］将64Cu 与WL12螯合，形成[64Cu]WL12并注入到动物模型中，其PET图像显示hPD-L1肿瘤的肿瘤血液比（T/B）与肿瘤肌肉比（T/M）分别为25.6±1.9 与4.7±1.2，这与[64Cu]WL12 提供高信噪比的PD-L1 特异性图像的能力一致。将[64Cu]WL12与过量WL12（50 μg）注入小鼠模型中显示，注射2 h后对比小鼠PD-L1阳性肿瘤中放射性含量。相比于对照组，注射过量WL12的小鼠表达PDL1肿瘤组织放射性含量下降了75%。结合上述研究，有学者基于68Ga半衰期与WL12的药物动力学性质相符，将68Ga 与WL12 结合形成新PD-L1 示踪剂[68Ga]WL12，[68Ga]WL12在注射入小鼠后15 min即被摄取，在60 min 与120 min 时，T/B 值分别为7.56±16.47 与16.02±3.40［43］，这表明该种示踪剂在血液中的留存时间较少，其最佳T/M比值也远高于其他示踪剂（表1），竞争性抑制试验显示高PD-L1肿瘤中示踪剂含量明显降低，表明[68Ga]WL12对于PD-L1具有高亲和力。

5 总结与展望

Immuno-PET在肿瘤PD-L1表达的检测与定量中发挥着重要作用。尽管目前动物实验已经取得了进展，但用于人体诊断与治疗评估的Immuno-PET还存在很多问题。不仅需要改进现有的示踪标记物，而且还需要建立Immuno-PET 的临床诊断标准。限制Immuno-PET临床应用的因素有很多（如探头合成、计算机系统算法更新），但主要限制因素在于缺乏临床试验。

基于目前Immuno-PET表征PD-L1的发展趋势，期望在未来Immuno-PET在表征活体PD-L1上能有以下几个方面创新：（1）从与PD-1结合位点不同的新靶点出发研制新型示踪剂，以减少对免疫药物治疗的干扰；（2）尝试开发PD-L1的单链抗体与Fab片段示踪剂；（3）增加PET的敏感性与分辨率，以减少放射性显像剂对患者造成的损伤；（4）依据核素的化学配位更有针对性的进行螯合剂研究从而获取性质更加优良的PD-L1探头；（5）尝试Immuno-PET临床实验，从而为Immuno-PET的临床应用提供参考依据；（6）尝试建立患者Immuno-PET诊断的分级制度与临床诊断标准。随着新型示踪剂的开发与临床数据的不断积累，预计在不久的将来Immuno-PET活体表征PD-L1将会在肿瘤分子成像与免疫治疗方案的临床应用中发挥越来越重要的作用。