茶窖中微生物群落分布多样性及普洱茶内生菌和茶品质的研究

杨瑞娟 王桥美 彭文书 赵苗苗 李梅 严亮

(1 云南农业大学食品科学技术学院 云南昆明 650201;2 滇西应用技术大学普洱茶学院 云南普洱 665000;3 普洱茶研究院 云南普洱 665000;

4 云南农业大学植物保护学院 云南昆明 650201)

普洱茶是云南省地理标志保护产品［1］，具有历史性、原生态性、多样性等特征［2］，普洱茶因其得天独厚的地理条件和文化底蕴，越来越受消费者的喜爱，被评为中国茶叶区域公用第一品牌。

普洱茶是以云南大叶种［Camellia sinensis（Linn.） var.assamica（Masters） Kitamura］晒青毛茶为原料［3］，采用特定的加工工艺制成的具有独特品质特征的茶叶。按加工工艺及品质特征的不同，将普洱茶分为普洱生茶和普洱熟茶2种类型。普洱生茶是指未经发酵生产的晒青毛茶，既可作为绿茶直接饮用， 又可通过人工发酵技术快速转化为普洱熟茶［4］。普洱茶属于后发酵茶，以陈为尊，俗称“越陈越香”。一款优质普洱茶的形成离不开优质原料、精湛工艺、科学仓储这3大要素，好的仓储条件能促使普洱茶的风味品质逐渐得到改善，普洱茶存放以缩短仓储时间，最大可能提高茶叶品质，创造更高的经济效益［5］为目的，于是同法国葡萄酒、中国茅台酒一样，科学仓储成了普洱茶生产工艺的一个重要组成部分。近年来，关于普洱茶仓储的研究比较多［6-11］，但影响因子主要集中在水分、温度、光照、氧气、压力等，微生物的研究尚未见报道。

目前，普洱茶发酵微生物的研究很多，但是普洱茶存放环境微生物的研究很少，与品质结合的研究基本没有，本文选取新兴的普洱茶专业茶窖为研究对象，应用纯培养和测序技术对普洱茶窖的环境微生物群落结构特征进行初探，并对茶窖存放的普洱茶的内生菌和茶品质进行研究，旨在研究微生物群落结构与普洱茶品质变化之间的相关性，进而为促进普洱茶仓储技术的进一步发展和实际生产中普洱茶的仓储存放提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶样

XY：从茶树上直接采摘的茶鲜叶；

BC1：普洱茶压饼成型后，自然环境存放，温湿度随着普洱市的气候而变化；

BC2：普洱茶压饼成型后，放置于普洱茶窖，常年恒温恒湿（34.5℃，70%）保存。

BC1 和BC2 是同一批出厂的普洱茶，存放时间为两年（2016年6月至2018年8月）。

1.1.2 培养基

LB 培养基配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂18 g/L；用途为筛选、培养细菌。

YEPD 培养基配方：酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂分别为10、20、20、18 g/L；用途为筛选、培养酵母。

PDA 培养基配方：马铃薯、葡萄糖、琼脂分别为 300、20、（15～20）g/L；用途为筛选、培养真菌。

高氏培养基配方：可溶性淀粉、氯化钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、7H2O硫酸铁、琼脂分别为20、0.5、1、0.5、0.5、0.01、（15～20）g/L；用途为筛选、培养放线菌。

1.2 方法

1.2.1 微生物的培养

1.2.1.1 茶窖中墙面、地面、水和菌斑微生物的采集和培养

将所采墙面和地面的土壤分别置于灭菌的培养皿中自然风干1 周左右，取10 g 于90 mL 的无菌水中，振荡20 min，使其中微生物充分分散，得到10-1倍样品稀释液。用无菌移液枪吸取10-1菌悬液1 mL，加入装有9 mL无菌生理盐水的试管中，振荡混匀，配制 10-2、10-3、10-4、10-5菌悬液，把 10-3、10-5两个梯度的土悬液 100 μL 均匀涂于 LB、YEPD、PDA 和高氏培养基平板中。采集的水样也用无菌水稀释，同上所述，将10-3、10-5两个梯度涂布于4种培养基。菌斑采集：用无菌的棉签擦拭菌斑处，将棉签放入无菌水中浸泡（无菌水能没过棉签即可），之后将菌悬液涂布于4种培养基。

1.2.1.2 茶样内生菌的培养

对茶样进行如下处理：经无菌水冲洗10 min→2.5%硫代硫酸钠浸洗10 min→5%次氯酸钠浸洗3 min→75%乙醇浸洗5 min→再用无菌水冲洗10 min，用装好已灭菌刀头的组织粉碎仪对茶叶进行破碎，之后将茶叶与无菌水比例为1∶9（10 克茶叶90 mL水）的比例进行稀释，制备成10-1的稀释液，之后将10-3、10-42个浓度的稀释液100 μL涂布到4种培养基上。

将涂布结束的LB 培养基平板倒置于37℃培养箱，将涂布结束的YEPD、PDA和高氏培养基平板倒置于28℃培养箱，培养48～72 h，并对菌种进行划线纯化培养，备用。

1.2.2 微生物的鉴定

将纯化的微生物制成菌悬液进行PCR 反应［12-13］，细菌引物为 27F （5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′） 和 1492R （5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），真菌引物为ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'） 和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），将扩增成功的样品送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。根据测序结果，在GenBank数据库中挑选与靶序列相似度为100%的参考菌株序列，查出相应微生物，完成菌种鉴定。

用多序列对比软件Clustal X 1.81 进行同源性比较并匹配排序，然后用系统发育分析MEGA5.1软件包分析，构建邻接（Neighbor-joining，NJ）树进行系统发育分析。NJ 树构建采用HKY85 距离矩阵，启发式搜索，Bootstrap（1 000 次重复）检验，制作系统树［14］。

1.2.3 茶品质的鉴定

1.2.3.1 理化指标的检测

茶叶中的水浸出物、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱、游离氨基酸总量和含氟量分别按着标准GB/T 8305—2013 《茶 水浸出物测定》、GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T23193—2008（茶叶中茶氨酸的测定高效液相色谱法）、GB/T8312—2013（茶咖啡碱测定）、GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》和GB/T5009.18—2003（食品中氟的测定）的规定检测。茶多糖、茶色素分别按照可溶性糖-蒽酮比色法和直接萃取比色法［15］来检测。

1.2.3.2 安全指标的检测

农残和致病菌检测：由普洱市质量技术监督综合检测中心完成，其中农残按照GB2763—2005《食品中最大农药残留限量》的规定进行检测，致病菌按照GB29921—2013《食品中致病菌限量》的规定进行检测。

1.2.3.3 感官评定

由具有评茶职业资格的五位高级评茶员完成。

2 结果与分析

2.1 基于16S rRNA 基因系统进化的茶窖环境细菌群落组成分析

对纯化得到的157株细菌（墙面、水和地面中分别分离到88 株、40 株、29 株）形态学去重复后进行16S rRNA 基因测序、比对，挑取代表序列构建系统发育树如图1 所示。茶窖环境中的细菌可以归类到不动杆菌属Acinetobacter、芽孢杆菌属Bacillus、伯克氏菌属Burkholderia、色杆菌属chromobacterium、棒状杆菌属corynebacterium、微小杆菌属Exiguobacterium、马赛菌属Massilia、微杆菌属Microbacterium、微球菌属Micrococcus、假单胞菌属Pseudomonas、鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium、葡萄球菌属Staphylococcus、链霉菌属Streptomyces等属中。

2.2 基于ITS 基因系统进化的茶窖环境真菌群落组成分析

对纯化得到的119株真菌（墙面、水和地面中分别分离到39 株、37 株、43 株）形态学去重复后进行ITS基因测序、比对，挑取代表序列构建系统发育树如图2 所示。茶窖环境中的真菌可以归类到曲霉属Aspergillus、Blastobotrys、枝孢属Cladosporium、附球菌属Epicoccum、Meyerozyma、青霉菌属Penicillium、根毛霉属Rhizomucor等属中。

图1 采用邻接法分析16S rRNA序列构建的细菌系统树

2.3 茶窖中菌斑的培养鉴定结果

对茶窖中长期累积的菌斑进行取样分析，分离鉴定得到的微生物结果如表1，菌落与标准株相似度均为100%，其中曲霉属20 株，其中黑曲霉Aspergillus niger8 株，青霉属Penicillium、枝孢菌属Cladosporium、小球壳属Mycosphaerella等共计3属，5株。

2.4 普洱茶内生菌组成及属间特征分析

对纯化得到的163株（鲜叶、自然存放的茶和窖藏茶中分别分离到83、31、49 株）细菌形态学去重复后进行16SrRNA 基因测序、比对，挑取代表序列构建系统发育树如图3 所示。茶样中的细菌可以归类到无色杆菌属Achromobacter、芽孢杆菌属Bacillus、短芽孢杆菌属Brevibacillus、金黄杆菌属Chryseobacterium、肠杆菌属Enterobacter、草螺菌属Herbaspirillum、泛菌属Pantoea、拉乌尔菌属Raoultella、黄杆菌属Xanthomonas等属中。

图2 采用邻接法分析ITS序列构建的真菌系统树

由表2可知，鲜叶、自然存放和窖藏茶的内生菌群落均含有无色杆菌属Achromobacter、芽孢杆菌属Bacillus、肠杆菌属Enterobacter。鲜叶内生菌共分离菌株83 株，分布于12 个属，以芽孢杆菌属Bacillus、金黄杆菌属Chryseobacterium、无色杆菌属Achromobacter、黄杆菌属Flavobacterium、草螺菌属Herbaspirillum和拉乌尔菌属Raoultella为主要类群，其相对分离频率依次为28.92%、 21.69%、 14.46%、 9.64%、 7.23% 和6.02%。自然存放茶共分离菌株31 株，分布于6 个属，菌落丰富性不高，其中无色杆菌属Achromobacter和肠杆菌属Enterobacter相对分离频率最高，均为35.48%，其次是芽孢杆菌属Bacillus，相对分离频率为19.35%。窖藏茶共分离菌株49株，分布于7个属，菌落丰富度比自然存放的茶高，以芽孢杆菌属Bacillus、无色杆菌属Achromobacter和肠杆菌属Enterobacter为主要类群，相对分离频率依次为42.86%、22.45%和22.45%。

金黄杆菌属Chryseobacterium、黄杆菌属Flavobacterium、草螺菌属Herbaspirillum、泛菌属Pantoea、假单胞菌属Pseudomonas、拉乌尔菌属Raoultella、志贺氏菌属Shigella和黄杆菌属Xanthomonas在鲜叶中含有，而不同环境存放两年的茶中没有检测到。埃希氏菌属Escherichia、杆菌属Geobacillus、细杆菌属Microbacterium鲜叶中没有检测到，而存放两年的茶中都有。自然存放和窖藏茶的微生物种类比较相似，唯一的不同是短芽孢杆菌属Brevibacillus，自然存放的茶中没有，而窖藏的茶中含有。

表1 茶窖中菌斑培养鉴定结果

2.5 普洱茶（生茶）内含物及茶品质结果

自然存放和窖藏茶的安全指标（重金属、农残、大肠菌落数和致病菌）结果显示：铅含量、大肠菌落数、氯菊酯、联苯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、顺式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、乐果、六六六、敌敌畏、滴滴涕、杀螟硫磷、喹硫磷和乙酰甲胺磷都不超标，沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌等致病菌均未检出。

由表3可知，自然存放和窖藏茶的水分、灰分和水浸出物都符合GB/T 22111—2008《地理标志产品普洱茶》的规定，且茶多酚、咖啡碱、儿茶素、游离氨基酸、茶氨酸、茶色素（茶红素、茶黄素、茶褐素和花青素）和氟化物的含量相差不大，唯一差别大的是茶多糖，窖藏茶茶多糖的含量是自然存放茶的两倍。

感官评定结果显示，自然存放茶饼形端正，色泽黄褐，表面光滑匀整，香气纯正，滋味醇和，汤色橙黄明亮，窖藏茶饼形端正，色泽黄褐，表面光滑匀整，香气纯正，滋味醇厚，汤色橙红明亮，自然存放茶和窖藏茶原料都来自景迈山，所以香气都是典型的兰花香，相比之下，窖藏茶比自然存放茶的汤色更深，也说明内含物转化的更多更快。

3 讨论与结论

茶窖是一个新兴概念，所有的探索和研究尚处于初级阶段，前期我们探索了茶窖中空气微生物的分布特征，发现茶窖空气微生物群落以链霉菌属Streptomyces、曲霉属Aspergillus、芽孢杆菌属Bacillus和葡萄球菌属Staphylococcus为主要类群［16］，本文又利用传统平板培养法和分子生物学测序法相结合，对普洱茶茶窖中墙面、地面、水中的微生物和长期积累的菌斑进行了分离和鉴定，对茶窖环境微生物的进一步研究发现，茶窖中墙面、地面和水中共有最多的微生物菌属是曲霉属Aspergillus和芽孢杆菌属Bacillus（图1、2），茶窖长期积累的菌斑也以曲霉属Aspergillus为主。茶鲜叶和不同环境存放两年的普洱茶内生菌的分离和鉴定结果表明，鲜叶、自然存放茶和窖藏茶均含有大量的芽孢杆菌属Bacillus，且均未分离到真菌。综上所述，茶窖环境中最多的真菌属为曲霉属Aspergillus，最多的细菌属为芽孢杆菌属Bacillus。

图3 采用邻接法分析16S rRNA序列构建的细菌系统树

经过对不同存放环境中茶叶内含物和口感的比较发现，自然存放茶的茶红素高于窖藏茶，而茶褐素却低于窖藏茶（表3），这说明窖藏茶转化的更快，这跟普洱茶的发酵过程很相似，在普洱茶发酵过程中，随着发酵时间的增加，茶红素含量下降，茶褐素积累，茶褐素对普洱茶汤色红褐品质的形成具有至关重要的作用［17］，这也正可以解释为什么存放时间一样，而窖藏茶的汤色却更深。本文中分离到的茶窖环境中的细菌和茶叶内生菌以杆菌属为主。有报道称杆状菌亦可以产生丰富的多酚氧化酶、过氧化物酶等，可以促进儿茶素的转化，有利于普洱茶品质的提高［18］。付秀娟等［19］研究认为，普洱茶发酵过程中，霉菌对茶褐素含量的影响最大，酵母次之，细菌最小。这次在茶窖环境中（空气、水）分离到了黑曲霉，而且茶窖常年累积的菌斑经过培养鉴定，一半以上是曲霉属，且黑曲霉占大多数，这说明黑曲霉常年的聚集可能是影响茶品质关键的因素，有学者研究证明，黑曲霉中的单宁酸、单宁酶具有降解和水解单宁，产生没食子酸，使普洱茶汤色形成深红色的作用［20-21］。在茶窖环境中还分离出了根霉属真菌。齐祖同［22］和朱宏涛等［23］研究发现，根霉属真菌（丝状菌种产L-乳酸的一种重要菌种）具有独特的凝乳酶，能集聚生成芳香的脂类物质，这可能与本研究中茶的兰花香有关系。咖啡碱是茶叶中主要的嘌呤碱，是构成茶汤的重要滋味物质，窖藏茶的咖啡碱略高于自然存放茶，也有可能是环境中大量的黑曲霉影响所致。有研究发现黑曲霉可以显著增加咖啡碱的含量［24］。王茹芸等［25］研究发现，但随着普洱茶贮藏时间的加长，普洱茶中游离氨基酸总量明显降低，其中丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸已基本消减。本研究中窖藏茶中的游离氨基酸总量和茶氨酸的含量均低于自然存放茶，这更加说明窖藏茶比自然存放的茶转化的更快。窖藏茶的咖啡碱略高于自然存放茶，但茶汤并不苦涩，滋味更加醇厚，这可能是因为呈苦味的茶叶生物碱（包括咖啡碱）与茶色素通过某种作用结合，

使其呈味物质协调重组密切相关。

表2 鲜叶、自然存放与窖藏茶内生菌细菌菌株数量及相对分离频率（RF）

表3 窖藏茶仓储茶理化指标对比

本文利用平板稀释涂布分离，获取纯的培养物（微生物菌株），再通过分子生物学技术及分类鉴定等手段进行鉴定，进而分析确定纯培养物归属。在研究得到茶窖环境微生物群落组成和差异的同时，保存了大量微生物菌种资源，这与免培养方法相比具有极大优势。后续研究将通过检索相关微生物资源信息及应用，进一步探究具有特定功能的微生物变化对茶叶品质的影响。