响应面法优化山地五月茶黄酮提取工艺

范春雅 樊雪琼 郭教玲 谢世莹 李娟 周丹

(海南医学院药学院 海南海口 571199)

山地五月茶（Antidesma montanum），是大戟科五月茶属植物，主产于广东、海南、广西等地。五月茶属植物通常以根、叶、茎入药，具有健脾、抗炎、抗菌、镇痛、生津、活血、收敛、解毒等功效［1］。山地五月茶，在海南分布广泛。民间常将其与眼树莲合用治疗眼疾。前期研究表明，山地五月茶安全无毒，有很好的药理活性和开发前景［2-3］。

黄酮类化合物是植物界分布最为广泛的一大类次生物质，具有很好的药理生理活性，如治疗心脑血管系统和消化、呼吸系统疾病；抗癌、镇痛、抗炎、抗菌，消除自由基、抗氧化、抗衰老等，抗病毒及提高机体免疫力等，已被列为保健食品的一类功能因子［4-5］。黄酮的提取方法有溶剂提取法、吸附法、超临界流体萃取法、碱溶酸沉法等。溶剂法是提取黄酮类化合物最常用的方法，此法操作简单、易行。李萍［6］用溶剂法提取苹果属植物叶片中的类黄酮，发现影响提取率的关键因素有提取剂浓度、料液比，其次为提取温度和时间；此外，类黄酮在提取过程中可能会发生氧化反应，可采用在提取剂中加入BHT（二丁基羟基甲苯）、抗坏血酸等还原剂加以预防。黄酮的测定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等［7-10］。紫外分光法能快速地测出黄酮的含量，操作简便，因而得到广泛应用［11］。

本研究旨在探讨山地五月茶总黄酮的提取工艺，并采用响应面法优化提取工艺条件，为山地五月茶的研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与试剂

山地五月茶地上部分采自海南省万宁市兴隆县，经海南医学院曾念开教授鉴定为山地五月茶（Antidesma montanum）。

芦丁标准品（批号20771，上海源叶生物科技有限公司）、无水乙醇（西陇科学股份有限公司）、亚硝酸钠（西陇科学股份有限公司）、氢氧化钠（西陇化工股份有限公司）、硝酸铝（天津市科密欧化学试剂有限公司）。所有试剂级别均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.1.2 仪器

UV 1800C型紫外可见分光光度计（上海凤凰仪器有限公司）；AE100 型电子分析天平（南京庚辰科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 山地五月茶黄酮的提取与含量测定

1.2.1.1 山地五月茶黄酮的提取

准确称取2 g 样品粉末于100 mL 圆底烧瓶中，加入60%乙醇20 mL，于80℃下加热回流提取2 h，离心过滤；提取3 次，合并滤液，用60%乙醇定容至100 mL，即得山地五月茶样品溶液［12］。

1.2.1.2 标准曲线的绘制

准确称取干燥芦丁标准品20 mg于50 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，即得浓度为0.400 0 g/L的标准溶液［13］；准确吸取芦丁标准液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50 mL 于比色管中，分别加入5%NaNO2溶液1.00 mL，摇匀后静置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1.00 mL，摇匀后静置6 min，加入4% NaOH 溶液4.00 mL，用无水乙醇定容至10 mL，摇匀并静置10 min，于500 nm 处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（g/L）为横坐标［10］，绘制标准曲线。

1.2.1.3 黄酮含量的测定

准确移取1.00 mL 样品液于比色管中，按“1.2.1.2 标准曲线的绘制”测定吸光度；根据标准回归方程计算黄酮得率。总黄酮得率公式如下（Y）：

Y=CV/M

式中：Y为黄酮得率，单位为1；C为提取液浓度，g/mL；V为提取液原始体积，mL；M为所称取山地五月茶粉末质量，g。

1.2.2 山地五月茶黄酮提取工艺优化

以乙醇为溶剂对山地五月茶进行加热回流提取，结合单因素试验，利用响应面法对山地五月茶黄酮的提取工艺进行优化。

1.2.2.1 单因素实验

分别考察乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对山地五月茶加热回流提取效果的影响（表1），黄酮含量测定方法同“1.2.1.3 黄酮含量的测定”。

表1 加热回流提取的条件

1.2.2.2 响应面法优化提取工艺

结合上述单因素试验结果，采用4 因素3 水平进行响应面法优化设计，试验因素与水平如表2所示。自变量的试验水平分别以-1、0、1 进行编码，共设计29个试验点。

表2 试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制与黄酮含量的测定

按“1.2.1.2 标准曲线的绘制”，依次测得各标准溶液吸光度。以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。线性方程为A=0.229 4C+0.023 7，相关系数r=0.999 1。

图1 标准曲线

2.2 山地五月茶黄酮提取工艺优化

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 乙醇浓度对提取效果的影响

在提取时间为1 h、料液比为1∶40、提取温度为60℃、提取3 次的条件下，考察不同乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）对山地五月茶黄酮提取效果的影响，结果如图2 所示。由图2 中可知，乙醇浓度对样品中黄酮的提取影响较大，随着乙醇浓度的增加，黄酮的含量呈先升高而后下降的变化趋势；当乙醇浓度为50%时，总黄酮含量最高。这说明山地五月茶中中等极性的黄酮苷类物质含量比较高，当乙醇浓度大于50%时，溶剂极性降低，导致部分黄酮苷类物质不能溶解，某些脂溶性杂质溶出，使黄酮提取率降低。因此，最佳乙醇浓度为50%。

2.2.1.2 料液比对加热回流提取效果的影响

图2 乙醇浓度对提取效果的影响

在提取时间为1 h、乙醇浓度为60%、提取温度为60℃、提取3 次的条件下，考察1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 料液比对山地五月茶黄酮提取效果的影响，结果如图3所示。当料液比为1∶30 时，总黄酮提取率达到峰值。继续提高料液比，黄酮提取率反而下降。这可能是因为已浸出的大量杂质影响了黄酮的浸出率；或者是因为已浸出的大量黄酮对剩余黄酮有协同浸提作用［9］。

图3 乙醇体积对提取效果的影响

2.2.1.3 提取时间对加热回流提取效果的影响

在提取温度为60℃、料液比为1∶40、乙醇浓度为60%、提取3次的条件下，考察提取时间（30、60、90、120、150 min）对山地五月茶黄酮提取效果的影响，结果如图4 所示。从图4 可知，黄酮含量随着提取时间的延长而升高，当提取时间为90 min 时，黄酮含量达到极值，之后又逐渐降低。因此，最佳提取时间为90 min。

2.2.1.4 提取温度对加热回流提取效果的影响

在提取时间为1 h、料液比为1∶40、乙醇浓度为60%、提取3次的条件下，考察不同温度（50、60、70、80、90℃）对山地五月茶黄酮提取效果的影响，结果如图5 所示。从图5 可知，黄酮含量随着提取温度的升高呈现先升后降的趋势，在温度为80℃时含量最高。这是因为升温加速了黄酮类物质的渗透、扩散、溶解等，更有利于黄酮的提取；但过高的温度易使黄酮类物质氧化变性，从而导致提取率下降［7］。因此，最佳提取温度为80℃。

图4 提取时间对提取效果的影响

图5 提取温度对提取效果的影响

2.2.2 响应面法优化提取工艺

2.2.2.1 回归方程建立与方差分析

根据单因素试验结果，以料液比（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为自变量，山地五月茶黄酮得率为因变量进行响应面法设计（表2），共设计29 个试验点，响应面法优化提取工艺分析方案及结果如表3所示。

利用Design-Expert 8.0 软件对表3 的数据进行分析，方差分析结果见表4。由表4 可知，料液比（p＜0.01）和乙醇浓度（p＜0.50）对总黄酮的提取影响显著。以山地五月茶中总黄酮得率（Y）为响应值，经回归拟合后，得到回归方程：

Y=0.866-2.95×10-3A+6.415×10-3B-0.015C-6.56×10-3D+3.75×10-5AB+5.5×10-5AC+2.5×10-5AD+3.5×10-5BC+1.08×10-5BD+6.92×10-5CD-7.02×10-5A2-1.08×10-4B2+3.67×10-5C2-2.04×10-6D2

表3 响应面优化分析方案

由表4 可知，该模型显著（p= 0.0048＜0.05），失拟项不显著 （p= 0.9045＞0.05），决定系数R2=0.812 5，说明有81.25%的变差能够由该模型解释；变异系数CV为8.94%，说明变异（偏离）程度较小。因此，该模型具有良好的拟合度，能真实地描述各因素与响应值之间的关系，可对山地五月茶黄酮的提取条件进行预测和分析［14］。

2.2.2.2 各因素响应面交互作用分析

将2 个因素固定在0 水平，通过Design-Ex-pert 8.06 软件统计分析，观察其余2 个因素的交互作用。通过响应面和等高线图，分析各影响因素的响应面交互作用。由图6-a可知，响应面坡度都比较陡峭，说明料液比（A）和乙醇浓度（B）对黄酮提取率影响较大［8］。由响应面的等高线图（图6-b）可知，等高线为椭圆形，说明料液比和乙醇浓度这2个自变量间交互作用较强。通过软件分析得知，山地五月茶总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度57.38%、料液比1∶39.58、提取温度84.15℃，加热回流提取101.13 min，在此条件下，预期山地五月茶黄酮得率可达到0.121 0。为实际操作方便，实际的最优提取条件为乙醇浓度57%、料液比1∶39、提取温度84℃，加热回流提取100 min，进行3 次重复实验，山地五月茶总黄酮得率平均值为（0.118 9±0.02），与预测值接近，说明此响应面法得到的回归模型具有一定的可靠性。

表4 方差分析

4 结论

本实验研究了山地五月茶黄酮的提取工艺，通过单因素试验和响应面分析法确定了山地五月茶黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度57%、料液比1∶39、提取温度84℃、加热回流提取100 min，黄酮得率为（0.118 9±0.02）。

图6 乙醇浓度和料液比交互作用对黄酮得率影响的响应曲面图和等高线图

此提取工艺操作简便、工艺成熟、提取率高、绿色环保，将为山地五月茶的研究开发提供实验依据。