基于HS-SPME-GC-MS的4种不同蝴蝶兰种质资源花朵挥发性成分比较分析

肖文芳 李 佐 陈和明 吕复兵

(广东省农业科学院 环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广州 510640)

花香是观赏作物最重要的品质之一。迄今为止，已从1 000余种花卉中鉴定出1 700多种挥发性物质，主要分为萜类化合物、苯丙酸类化合物/苯环型化合物和脂肪酸衍生物三大类，其中萜类化合物是最主要也是最多元化的组分[1]。研究发现，兰科植物花香挥发性成分主要为萜类化合物，但不同种属之间种类和含量均存在较大差异，甚至同一个种的不同品种之间差异也较大。鼓槌石斛的主要香气成分为乙酸辛酯、β-罗勒烯、α-蒎烯和苯乙醛[2]，而流苏石斛的主要香气成分则为α-蒎烯(45.06%)和β-蒎烯(23.22%)[3]；国兰中，蕙兰鲜花的主要香气成分为桉油精(14.49%)和(E)-4-己基葵烯-6-炔(8.97%)，墨兰鲜花的主要香气成分为甲基-异丁子香酚(17.70%)和6-氧代庚酸甲酯(14.16%)，春兰鲜花的主要香气成分则为α-芹子烯(30.05%)和十二烷(14.75%)[4]；具巧克力香味的文心兰‘Sharry Baby’的主要香气成分为3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(61.58%)[5]，而具芳香味的‘Rosy Sunset’这一品种的主要香气成分为沉香醇(52.80%)和苯甲醛(9.25%)[6]；杂种卡特兰‘3G’的主要香气成分为3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇(30.15%)、3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯(16.63%)和壬烷(12.77%)[7]。

蝴蝶兰(Phalaenopsis)，原产于亚洲热带地区至澳大利亚，分4个亚属共70多个原生种，其中接近一半具花香[8]。蝴蝶兰商品品种为优选的原生种杂交后代，长达200年的杂交育种过程中育种家一直过于追求花朵数和花朵大小等性状，导致目前市场流行品种基本不具备花香这一优良观赏性状。随着市场需求的变化和发展，香花品种的选育已成为急需突破的瓶颈之一。目前对蝴蝶兰花朵挥发性成分的研究极少且只集中在原生种上，Hsiao等[9]发现浓香型的荧光蝴蝶兰(Phal.bellina)和大叶蝴蝶兰(Phal.violacea)中花朵挥发性成分主要为芳樟醇、香叶醇及其衍生物，Awano等[10]发现淡香型的西蕾丽蝴蝶兰(Phal.schilleriana)中主要挥发性成分为乙酸橙花酯、橙花醇、香茅醇及乙酸香茅酯，而嗅感无香的小兰屿蝴蝶兰(Phal.equestris)的挥发物主要为2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol、2-乙基己醇和2-己醇[11]。但针对个别种质资源的分散研究不足以说明蝴蝶兰花朵挥发性成分的一般规律和主要特征，特别是在缺乏对商品品种的研究和分析的情况下，目前急需对不同种质资源，包括原生种和商品品种进行交叉比较，分析嗅感具花香与不具花香种质资源花朵挥发性成分的差异，筛选蝴蝶兰花朵主要致香成分，为香花品种的选育提供理论支撑。

HS-SPME-GC-MS技术是目前广泛应用的兰花花朵挥发性成分鉴定方法[3-11]。本研究以4个不同蝴蝶兰种质资源为试验材料，包括1个原生种、1个原生种间的杂交种和2个商品品种，其中2个种质资源具花香，2个不具花香，采用HS-SPME-GC-MS技术检测其花朵挥发性成分并进行定性及定量分析，通过香气强度值和香气品质分类对不同种质资源进行香气特征分析，构建具花香与不具花香蝴蝶兰种质资源花朵挥发性成分对比数据库，寻找影响嗅感的主要致香成分，以期为蝴蝶兰香花品种的选育提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

嗅感不具花香的蝴蝶兰种质资源2个：N1(Phal. Frigdaas Yellow Koer，广东省农业科学院环境园艺研究所自主选育新品种)和N2(Phal. Sogo Vivien，市场流行商品品种)，嗅感具浓郁花香的种质资源2个：F1 [(Phal.javanica×Phal.hieroglyphica)×Phal.violacea，原生种杂交后代]和F2(Phal.bellinah.f. coerulea，原生种)(图1)。4个蝴蝶兰种质资源均栽培保存于广东省农业科学院环境园艺研究所白云基地兰花资源圃中。2018年12月花期时，在晴朗的上午10:00采集盛开第5天的花朵[11]，液氮速冻15 min后放入超低温冰箱备用。

(a)嗅感不具花香蝴蝶兰种质资源N1；(b)嗅感不具花香蝴蝶兰种质资源N2；(c)嗅感具花香蝴蝶兰种质资源F1；(d)嗅感具花香蝴蝶兰种质资源F2

1.2 试验方法

1.2.1顶空固相微萃取

取处理好的冷冻样品，研磨均匀后取0.5 g放入连接萃取头(Sigma-Aldrich, 50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex/SS, 2 cm)的20 mL顶空瓶中，再加入10 μL 2-辛醇(10 mg/L，溶于水中)为内标，60 ℃预热15 min，萃取30 min后，上GC-MS测定。

1.2.2GC-MS分析条件

仪器为Agilent 7890B GC-5977B MS，色谱柱为Agilent的DB-Wax(30 m×250 μm×0.25 μm)。不分流模式进样，以氦气为载气，隔垫吹扫流速为3 mL/min，柱流速为1 mL/min。初始温度40 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持5 min。前进样口温度、传输线温度、离子源温度和四级杆温度分别为250、250、230和150 ℃，电离电压设定为-70 eV。以扫描方式获得质谱数据，质谱检测范围为20～500 m/z，溶剂延迟时间为0 min。

1.3 数据分析

使用ChromaTOF软件(V 4.3x，LECO)和NIST库对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐和质谱匹配等分析[12]。

通过峰面积进行归一化定量[13]，其中相对含量为组分峰面积与总峰面积之比。

组分挥发物含量按内标法计算如下[14]：

(1)

式中：Wx为某组分含量，mg/kg；Ax为某组分挥发物的峰面积；nis为内标物物质的量，mol；Mx为某组分摩尔质量，g/mol；Ais为内标物的峰面积，m0为样品取样量，kg。

香气强度值(Odor-activity values, OAVs)的计算公式如下[14]：

(2)

式中：Tx为某组分挥发物根据文献查询得到的香气阈值，mg/kg。

2 结果与分析

2.1 4个不同蝴蝶兰种质资源花朵挥发性成分类型及含量

采用HS-SPME-GC-MS测定4个不同蝴蝶兰种质资源花朵的挥发性成分，根据总离子流色谱图、ChromaTOF软件和NIST库质谱匹配结果对检出峰进行鉴定。通过峰面积进行归一化对挥发物含量进行相对定量，通过内标法计算挥发物含量。

4个不同蝴蝶兰种质资源累计共检出365个物质，其中F1中鉴定出279个物质，F2中277个物质，N1中224个物质，N2中285个物质。4个不同种质资源中共同检出的物质120个，只在3个中检出的物质98个，只在2个中检出的物质147个，没有仅在1个中检出的物质。根据相对峰面积含量逆序排列，取每个种质资源累计含量超过90%且相似度高于700的物质，共46个(表1)进行挥发性成分特征分析，其中2-正戊基呋喃在两个不同的保留时间中均鉴定出，可能为同分异构体。46个挥发性成分分为单萜类、醛类、醇类、酮类、呋喃、酯类和肟7大类，其中醛类化合物种类最多，为16种，其次为单萜类化合物11种，醇类化合物10种，酮类3种，呋喃3种，酯类2种，肟1种(图2)。

表1 4个不同蝴蝶兰种质资源的花朵主要挥发性物质比较Table 1 Comparison of main volatile compounds in flowers of four different Phalaenopsis germplasms

表1(续)

表1(续)

图2 4个不同蝴蝶兰种质资源的花朵挥发物类型

4个不同种质资源中共同检出且相对含量占比最高的挥发物为青叶醛、黄瓜醛和己醛，在F1、N1和N2中的累加相对含量均超过了35.000 0%，在F2中的累加相对含量也达到了15.053 1%。由此可见，青叶醛、黄瓜醛和己醛可能是蝴蝶兰花朵的基础性挥发物，虽然不同种质资源中的挥发含量可能不同，但在总挥发物中的占比一般都较高。

2.2 4个不同蝴蝶兰种质资源花朵挥发性成分差异比较

4个种质资源根据嗅感分为香花组和无香组，其中香花组的特有检出物51个，含量最高的为芳樟醇单氧化合物(F1: 0.120 7 mg/kg，F2: 0.036 8 mg/kg)，无香组的特有检出物32个，含量最高的为反-2-己烯-4-氧代-醛(N1: 0.012 8 mg/kg，N2: 0.009 4 mg/kg)。

香花组样品F1的花朵挥发物主要为单萜类化合物芳樟醇(1.204 9 mg/kg)、醛类化合物黄瓜醛(0.654 5 mg/kg)和青叶醛(0.318 8 mg/kg)；F2的花朵挥发物主要为单萜类化合物香叶醇(0.518 0 mg/kg)、醛类化合物黄瓜醛(0.188 4 mg/kg)和醇类化合物乙酸二萘酯(0.138 5 mg/kg)。可见，香花组蝴蝶兰的花朵挥发性成分主要为单萜类、醛类和醇类化合物，但不同种质资源的挥发性成分种类及含量并不相同，具有特异性。

无香组样品N1的花朵挥发物主要为醛类化合物青叶醛(0.219 0 mg/kg)、己醛(0.159 4 mg/kg)、黄瓜醛(0.078 1 mg/kg)和酮类化合物乙烯基乙基酮(0.076 1 mg/kg)；N2的花朵挥发物主要为醛类化合物青叶醛(0.365 5 mg/kg)、己醛(0.250 0 mg/kg)、黄瓜醛(0.232 3 mg/kg)和酮类化合物乙烯基乙基酮(0.180 2 mg/kg)。虽然含量排名前4的挥发物在2个不同样品中种类相同而含量不同，但是后续排名相同的挥发物种类和含量则均不同，如样品N1花朵挥发物含量排名第5高的物质为单萜类化合物(E)-β-罗勒烯(0.033 6 mg/kg)，而样品N2花朵挥发物含量排名第5高的物质为醇类化合物己醇(0.159 9 mg/kg)。可见，无香组蝴蝶兰的花朵挥发性成分主要为醛类化合物和酮类化合物，但不同种质资源的挥发性成分种类及含量并不完全相同，具有特异性。

2.3 4个不同蝴蝶兰种质资源花朵主要挥发性成分香气强度与品质

OAVs为某一组分挥发物的含量与其香气阈值的比值，是衡量挥发性物质对香气贡献度的一个重要指标，挥发物的OAVs越大，对香气的贡献也就越大[14]。本实验对4个不同蝴蝶兰种质资源定性和定量分析了其花朵的45种主要挥发性物质(表1)，由于反-2-己烯-4-氧代-醛、2,2-二甲基-3-庚酮、4-氧-2-己烯醛、5-乙基环戊烯-1-乙醛和甲氧基苯肟未见香气阈值和香气特征报道，不能进行香气强度值计算和香气特征分析，试验对其余40种主要挥发物的香气强度值进行计算，其中2-正戊基呋喃的香气强度值计算中组分含量采用2个不同保留时间的含量相加。40种主要挥发物中甲醇为酒精味没有香气类型，顺-2-庚醛未见香气特征报道，对38种主要挥发物的香气特征进行分析[15]，发现蝴蝶兰花朵挥发性成分的香气类型主要为花香、青香、脂香、果香、辛香、蜡香、草药香、柑橘香和其他少数香型(木香、化学香、发酵香、土石型、醚香型和薄荷香型等)(表2和图3)。

表2 4个不同蝴蝶兰种质资源花朵主要挥发性成分香气强度与品质

表2(续)

表2(续)

图3 4个不同蝴蝶兰种质资源香气类型分布

在香花组的2个样品中，F1中OAVs大于1的物质有15个，F2中有12个，2个样品中OAVs最高的挥发物均为花香型的芳樟醇(F1: 5 476.997 6，F2: 470.599 7)，其次为青香型的黄瓜醛(F1: 818.175 8，F2: 235.555 9)和脂香型的反式-2-壬烯醛(F1: 328.791 2，F2: 398.975 4)，芳樟醇、香叶醇、黄瓜醛、反式-2-壬烯醛、乙酸二萘酯、2-正戊基呋喃和顺式-3-壬醇这7种成分对嗅感具花香蝴蝶兰花朵的气味构成具有主要作用。实际嗅感上，芳樟醇为浓青带甜的木青气息，既有紫丁香、铃兰香与玫瑰的花香，又有木香和果香气息，香叶醇的嗅感与芳樟醇类似，黄瓜醛、反式-2-壬烯醛和乙酸二萘酯为青香，2-正戊基呋喃具果香，顺式-3-壬醇具蜡香。F1与F2实际嗅感均为花香掺杂青香，且F1花香较F2浓烈，与测量分析结果显示的嗅感一致。在无香组的2个样品中，N1中OAVs大于1的物质有11个，N2中有14个，2个样本中OAVs最高的均为脂香型的反式-2-壬烯醛(N1: 131.422 6，N2: 376.477 6)，其次为青香型的黄瓜醛(N1: 97.633 8，N2: 290.383 5)和柑橘香型的环氧-2-癸醛(N1: 20.014 7，N2: 174.609 4)，反式-2-壬烯醛、黄瓜醛、环氧-2-癸醛和顺式-4-庚醛这4种成分对嗅感不具花香蝴蝶兰花朵的气味构成具有主要作用。实际嗅感上，反式-2-壬烯醛、黄瓜醛和顺式-4-庚醛均为青香，环氧-2-癸醛为柑橘香，N1与N2实际嗅感均为青香，与测量分析结果显示的嗅感基本一致。通过OAVs加和值进行香气系列分布分析发现，嗅感具花香蝴蝶兰中花香型挥发物占比最重，青香型和脂香型所占比重接近，不同种质资源具特异性，是嗅感具花香蝴蝶兰的主要香气特征；嗅感不具花香蝴蝶兰中青香型物质和脂香型物质占比最重，不同种质资源具特异性，是嗅感不具花香蝴蝶兰的主要香气特征。测量分析结果与实际嗅感基本一致，说明测量分析结果准确可信，部分物质的香气未能被嗅觉感知，如N1和N2中具柑橘香气的环氧-2-癸醛，可能源于人的嗅感较弱。

综合比较发现，嗅感具花香的蝴蝶兰种质资源与嗅感不具花香的蝴蝶兰种质资源花朵的香气特征区别主要来自于花香型挥发物芳樟醇和香叶醇含量的差异。嗅感具花香的蝴蝶兰花朵挥发物主要为花香型的芳樟醇和香叶醇，导致花朵嗅感为花香；嗅感不具花香的蝴蝶兰花朵挥发物主要为脂香型的反式-2-壬烯醛和青香型的黄瓜醛(嗅感均为黄瓜香气)，导致花朵嗅感为类似黄瓜的青香。芳樟醇和香叶醇是蝴蝶兰花朵的主要致香成分，其含量的多少决定蝴蝶兰花朵的嗅感是否具花香。

3 讨 论

蝴蝶兰是商品化程度最高的兰科植物，种质资源丰富，原生种中既有具浓郁花香的种，也有不具花香的种，而商品品种则基本不具花香[8]。前人对蝴蝶兰花朵挥发性成分的研究较少，只针对2个浓香型蝴蝶兰原生种、1个淡香型原生种和1个无香型原生种资源进行过花朵挥发性物质的分析[8-11]。本研究针对蝴蝶兰具花香种质资源和不具花香种质资源，包括了原生种及商品品种，进行交叉对比，在4个不同蝴蝶兰种质资源中共检测到365个挥发性物质，每个样本中检测到的挥发性物质都超过220种，数量明显高于前人研究中的10～50种[8-11]。对比相同样品荧光蝴蝶兰已有研究结果发现[10]，在相同取样时间取样测定(开花后第5天的晴朗早上)，花朵挥发性成分整体特征较为一致，但总挥发物含量、挥发物种类及含量上存在一定的差异；对比不同样品但同样表现为嗅感不具花香的种质资源的研究结果发现，在相同取样时间取样测定，原生种小兰屿蝴蝶兰的花朵挥发物主要为2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol、2-乙基己醇和2-己醇[11]，本研究中的2个不同蝴蝶兰种质资源的花朵挥发物均主要为青叶醛、己醛、黄瓜醛和乙烯基乙基酮。本研究结果与前人研究结果出现差异的可能原因有3方面：一是前人研究所采取的萃取条件不够优化和精度较低，只能检测到部分含量高或所用萃取柱吸附性好的化合物，而本研究采用更先进的检测仪器、吸附能力更强吸附范围更广的色谱柱和更优质的数据分析软件，能够更全面地反应出检测样品的挥发性成分特征；二是种质资源的差异，本研究发现蝴蝶兰不同种质资源花朵挥发性成分具特异性，与前人研究结果一致[8-11]；三是栽培环境的变化，Chuang等[39]发现蝴蝶兰花朵挥发性物质的释放受昼夜节律和光照的影响。

本研究通过蝴蝶兰具花香种质资源与不具花香种质资源的对比，确定了蝴蝶兰花朵主要致香成分为芳樟醇与香叶醇，与前人研究发现浓香型蝴蝶兰花朵挥发性成分主要为芳樟醇、香叶醇及其衍生物[9,11]基本一致。但本研究在嗅感不具花香的2个蝴蝶兰种质资源中均检测到微量的芳樟醇和香叶醇，说明嗅感不具花香的蝴蝶兰中也存在致香成分的合成及挥发，只是含量极低不能被人的嗅觉感知。前人只对1个嗅感不具花香的蝴蝶兰种质资源进行过花朵挥发性成分的研究，且检测精度较低，未检测到致香成分芳樟醇和香叶醇。本研究检测精度较高，且同时在2个不同的无香种质资源中均得出相同的检测结果，可信度更高。后续将对更多不同的蝴蝶兰种质资源进行检测，进一步验证本研究结果。

香花优良品种选育是目前蝴蝶兰育种工作的重点和难点之一。前人研究未在无香蝴蝶兰种质资源中发现芳樟醇和香叶醇等致香成分的挥发，认为无香蝴蝶兰种质资源中不存在致香成分的合成路径，导致针对无香种质资源的遗传改良一直停留在传统杂交育种上。但传统育种手段选育香花新品种存在极大的阻碍[40]：一是蝴蝶兰杂交育种周期较长，从亲本杂交到子代开花需3～4年，优良单株选择和克隆又需3年左右；二是具浓郁花香的种质资源荧光蝴蝶兰(Phal.bellina)、红脉蝴蝶兰(Phal.venosa)和虎纹蝴蝶兰(Phal.amboinensis)等的染色体为大型染色体，而作为市场主流商品品种常用育种亲本的台湾白花蝴蝶兰(Phal.aphrodite)、小兰屿蝴蝶兰(Phal.equestris)和淡香型的西蕾丽蝴蝶兰(Phal.schilleriana)等的染色体则为小型染色体，两者之间杂交亲和性极低；三是花香性状与其他市场追求的观赏性状之间负相关。目前，基因工程被认为是突破传统育种桎梏的最重要手段之一。前人研究发现，蝴蝶兰花香的释放受到昼夜节律和光照的影响，而这一调节作用依赖于单萜类化合物合成途径中结构基因和转录因子的共同作用[39]，其中关键结构基因为花部特异表达的PbGDPS，其表达量与荧光蝴蝶兰中单萜类物质的释放曲线一致[41]，主要受到转录因子PbbHLH4[42]和启动子区的顺势作用元件[40]等的调控。本研究发现无香种质资源中也存在致香成分的微量挥发，即致香成分的合成和运输途径是完整的，通过基因工程改造现有无香优良种质资源，既通过转基因或基因编辑等手段提高无香种质资源自身内源单萜类物质合成途径中关键酶基因(GDPS等)的表达量，打通下游致香成分的稳定合成与释放，更易实现不具花香种质资源的定向遗传改良，为选育符合市场需求的蝴蝶兰香花新品种提供了新的思路。

4 结 论

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法对具花香的蝴蝶兰种质资源和不具花香的蝴蝶兰种质资源花朵挥发性成分进行测定，发现不同种质资源花朵挥发性成分存在特异性，单萜类化合物芳樟醇和香叶醇是蝴蝶兰花朵的主要致香成分，具花香蝴蝶兰种质资源中的释放量最高，不具花香种质资源的花朵也存在未达嗅觉阈值的微量挥发。具花香蝴蝶兰种质资源花朵的主要香气类型为花香型、青香型和脂香型，不具花香蝴蝶兰种质资源中醛类化合物的释放量最高，主要成分为青叶醛、黄瓜醛和己醛，主要香气类型为青香型、脂香型和柑橘香型。