鲍氏不动杆菌核酸检测试剂盒国家参考品的研制

徐潇，石继春，王春娥，李康，黄洋，李江姣，梁丽，陈驰，叶强

中国食品药品检定研究院 中国医学细菌保藏管理中心，北京102629

鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是革兰阴性非发酵菌，在自然界和医院环境中广泛存在，为条件致病菌，主要感染抵抗力较低的个体，易在住院患者皮肤、口腔、呼吸道及泌尿生殖道等部位定植，是院内感染的重要病原菌之一［1］，可引起医院获得性肺炎、烧伤感染、伤口感染等疾病，特别是呼吸机相关性肺炎、脑膜炎、菌血症等。鲍氏不动杆菌在医院环境中可长期存活，对危重患者和ICU 中的患者威胁较大。据报道，ICU 患者的鲍氏不动杆菌感染率明显高于其他科室，尤其是下呼吸道感染［2］。同时，鲍氏不动杆菌还具有快速建立耐药的能力，其耐药性日益提高，特别是多重耐药菌的增多，甚至出现了对目前抗菌药物均耐药的全耐药鲍氏不动杆菌［3-6］。根据2018 年中国细菌耐药性监测网数据显示，鲍氏不动杆菌占临床分离革兰阴性菌的13.41%，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，且对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2005 — 2018 年呈快速上升趋势，达73.2%和73.9%，严重影响患者的预后，已成为最难以治疗和控制的院内获得性感染病原菌［7-8］。

临床采用细菌培养和基于生化反应来鉴定细菌的传统方法是诊断细菌感染的公认方法［3］，但其培养细菌时间较长，且易受接种时间和方法等因素影响，较难达到对感染早期诊断的目的，不能满足临床诊断需求［9-10］。鲍氏不动杆菌易于感染，尤其对ICU患者的危害较大，因此，快速、准确的诊断将有助于重症患者的及时治疗。核酸诊断技术速度快、灵敏性和特异性好，能够更早期地发现突发感染。目前，基于实时荧光定量PCR 的核酸检测法可用于鲍氏不动杆菌检测，但尚无相关国家参考品供企业对其研发的试剂盒进行质量控制和评价。参考品是诊断试剂审评审批的重要依据，不同企业的产品采用同一标准衡量，将有利于行业水平的整体提升［11-13］。因此，本研究研制了鲍氏不动杆菌核酸检测试剂盒国家参考品，以期为相关企业提供试剂盒质量控制和评价参考品，提升诊断试剂的质量。

1 材料与方法

1.1 菌株 从中国医学细菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）标准菌株库中选择10 株鲍氏不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）作为阳性参考菌株，菌种编号分别为CMCC（B）25012、CMCC（B）25014、CMCC（B）25006、CMCC（B）25019、CMCC（B）25020、CMCC（B）25022、CMCC（B）25047、CMCC（B）25105、CMCC（B）25141 及CMCC（B）25154；从CMCC 标准菌株库中选择同属不同种的不动杆菌及与鲍氏不动杆菌感染部位相同或感染症状相似且常见的其他病原菌（共10 株）作为阴性参考菌株，包括鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）、琼式不动杆菌（Acinetobacter junii）、溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌种编号分别为CMCC（B）25202、CMCC（B）25150、CMCC（B）25046、CMCC（B）60001、CMCC（B）31001、CMCC（B）29052、CMCC（B）46117、CMCC（B）44113、CMCC（B）26001、CMCC（B）10104。

1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白胨大豆培养基、LB培养基及哥伦比亚血琼脂基础培养基购自美国BD公司；BCYE 琼脂基础及配套添加剂购自青岛海博生物技术有限公司；无菌脱纤维羊血购自北京陆桥技术股份有限公司；中国细菌浊度标准国家标准品购自中国食品药品检定研究院；API 20NE 及配套试剂、VITEK GN 和GP 鉴定卡购自梅里埃诊断产品（上海）有限公司；DNeasy Blood & Tissue Kit 及蛋白酶K购自德国QIAGEN 公司；溶菌酶购自美国AMRESCO公司；Taq 酶及DNA marker DL2000 购自宝日医生物技术（北京）有限公司；GelRed 染色液购自北京科奥明生物技术有限公司；鲍曼不动杆菌核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）购自上海之江生物科技股份有限公司（厂家1）及江苏硕世生物科技股份有限公司（厂家2）；VITEK 全自动生化鉴定仪购自梅里埃诊断产品（上海）有限公司。

1.3 参考菌株的复苏及鉴定

1.3.1 参考菌株的复苏 不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌采用胰蛋白胨大豆培养基，于（37±1）℃培养18～24 h；嗜肺军团菌采用BCYE 培养基，于（37 ± 1）℃，5% CO2细胞培养箱培养48 h；肺炎链球菌采用哥伦比亚血平板，于（37±1）℃，5%CO2细胞培养箱培养18～24 h；脑膜炎奈瑟菌采用GC 培养基，于（37±1）℃，5%CO2细胞培养箱培养18 ～ 24 h。各菌株按上述条件进行复苏、传代。

1.3.2 参考菌株的鉴定 对第2 代培养物进行生化鉴定和16S rRNA 基因序列分析。不动杆菌采用API 20NE 进行生化鉴定，其他菌株采用VITEK 全自动生化鉴定仪鉴定。16S rRNA 基因序列分析采用DNeasy Blood&Tissue Kit 提取第2 代培养物DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增［14-16］，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger 双向测序，将测序结果导入BioNumerics软件（7.6 版）进行拼接处理，并于NCBI 数据库中进行BLAST 序列比对。

1.4 参考品的制备 取第2 代过夜培养物，液体培养物经7 656 ×g离心10 min，弃上清，灭菌生理盐水洗涤3 次，用灭菌生理盐水重悬；固体培养物刮至生理盐水中，制成菌悬液。采用中国细菌浊度标准国家标准品进行定量，无中国细菌浊度标准国家标准品的细菌采用平板计数法进行计数，将脑膜炎奈瑟菌CMCC（B）29052 及铜绿假单胞菌CMCC（B）10104 菌液浓度分别调至1.0 × 106和5.0 × 106个／ mL，其他18 株参考品菌液浓度均调至1.0 × 107个／ mL。将参考品菌液置60 ℃灭活60 min，不同菌株使用其适宜的培养基进行接种培养，验证灭活效果。

1.4.1 阳性参考品 用灭菌生理盐水稀释10 株阳性参考品菌液，按0.5 mL／支分装，标记为P1 ～P10。

1.4.2 阴性参考品 用灭菌生理盐水稀释10 株阴性参考品菌液，按0.5 mL／支分装，标记为N1 ～N10。

1.4.3 最低检出限参考品及重复性参考品 选择CMCC（B）25012 鲍氏不动杆菌作为最低检出限参考品和重复性参考品，用灭菌生理盐水将菌液稀释，按0.8 mL／支分装，分别标记为最低检出限参考品和重复性参考品。

1.5 参考品的均匀性评估 分别随机抽取P1 ～P10阳性参考品、最低检出限参考品各10 支，重复性参考品15 支，用灭菌生理盐水分别进行10 倍稀释，采用厂家1 生产的鲍曼不动杆菌核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）进行检测。结果应均为阳性，且每株参考品均匀性的变异系数（CV）应≤5.0%。

1.6 参考品的稳定性评估 将P1 ～P10 阳性参考品、最低检出限参考品分别于2 ～8、25、37 ℃放置3、7、14 d，同时，分别反复冻融3 和5 次，均以-20 ℃保存的参考品作为对照。阳性参考品（P1 ～P10）用灭菌生理盐水进行10 倍稀释；最低检出限参考品用灭菌生理盐水进行10 倍系列稀释，取1.0 × 106、1.0 × 105、1.0 × 104、1.0 × 103个／ mL 菌液，采用厂家1 生产的鲍曼不动杆菌核酸测定试剂盒（荧光PCR 法）进行检测，考察参考品于不同温度下放置不同时间及反复冻融的稳定性。

1.7 参考品的验证

1.7.1 准确性 将阳性参考品（P1 ～P10）分用灭菌生理盐水进行10 倍稀释，分别采用厂家1 和厂家2 生产的鲍曼不动杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）进行检测，每份样本平行检测2 次。每个试剂盒进行2 次独立试验，验证参考品的准确性。

1.7.2 特异性 将阴性参考品（N1 ～N10）用灭菌生理盐水进行10 倍稀释，分别采用厂家1 和厂家2生产的鲍曼不动杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）进行检测，每份样本平行检测2 次。每个试剂盒进行2 次独立试验。

1.7.3 重复性 将重复性参考品（10 支）用灭菌生理盐水进行10 倍稀释，分别用厂家1 和厂家2 生产的鲍曼不动杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）进行检测，每份样本平行检测2 次，重复检测10 次。每个试剂盒进行2 次独立试验，计算CV。

1.7.4 最低检出限 取最低检出限参考品（1.0 ×107个／ mL），用灭菌生理盐水进行10 倍系列稀释，取1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0 × 102个／ mL 菌液，分别采用厂家1 和厂家2 生产的鲍曼不动杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）进行检测，每份样本平行检测2 次。每个试剂盒进行2 次独立试验。

1.8 参考品的协作标定 共选择7 家实验室（编号为A ～G）参加协作标定，参照1.7 项方法采用各自实验室研发的诊断试剂对参考品进行验证，并对数据进行汇总分析。

1.9 统计学分析 应用SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析，稳定性结果采用单因素方差分析，组间比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 参考菌株的鉴定

2.1.1 生化鉴定 10 株不动杆菌及10 株其他菌株生化鉴定结果均符合相应菌株特性。

2.1.2 16S rRNA 基因序列分析 10 株不动杆菌及10 株其他菌株的序列分析结果符合每株参考菌株的种属特征，见表1。

2.2 参考品的灭活效果 全部参考品原菌液灭活验证平板均无细菌生长，表明参考品原菌液已成功灭活。

2.3 参考品的均匀性 阳性参考品、最低检出限参考品和重复性参考品Ct值的CV均＜2.5%，见表2。表明参考品的分装均匀度良好。

表1 16S rRNA 基因比对结果Tab.1 Alignment of homology of 16S rRNA gene sequence

表2 参考品分装均匀性验证结果（Ct 值）Tab.2 Uniformity of reference materials（Ct value）

2.4 参考品的稳定性

2.4.1 冻融稳定性 与-20 ℃保存的参考品比较，制备的参考品经反复冻融3 和5 次的Ct值差异无统计学意义（F分别为0.045 和0.011，P分别为0.833和0.918），见图1。表明制备的参考品具有较好的冻融稳定性。

图1 反复冻融对参考品稳定性的影响Fig.1 Stability of reference materials after repeat freezing and thawing

2.4.2 加速稳定性 与-20 ℃保存的参考品比较，分别于2 ～8、25、37 ℃放置3、7、14 d 的参考品Ct值差异均无统计学意义（F为0.315 ～2.303，P=0.141 ～0.579），见图2。表明制备的参考品具有较好的加速稳定性，可满足运输、使用等稳定性要求。

2.5 参考品的验证

2.5.1 准确性 两种试剂盒检测阳性参考品（P1 ～P10）稀释液的结果均为阳性，具体检测结果略。

2.5.2 特异性 两种试剂盒检测阴性参考品（N1 ～N10）稀释液的结果均为阴性，具体检测结果略。

2.5.3 重复性 两种试剂盒检测10 支重复性参考品的稀释液，每种试剂盒2 次独立试验的CV为0.87%～2.13%，均＜2.5%，见表3。

图2 保存温度及保存时间对参考品稳定性的影响Fig.2 Stability of reference materials after storage at various temperatures for various days

2.5.4 最低检出限 两种试剂盒对最低检出限参考品进行检测，验证试剂盒的最低检出限为1.0 ×103个／ mL。

2.6 参考品的协作标定 7 家参加协作标定的实验室检测阳性参考品符合率均符合要求；除D 实验室将3 个阴性参考品（为鲍氏不动杆菌同属不同种的干扰菌株）检测为阳性外，其他6 家实验室的阴性参考品符合率均符合要求；各实验室重复性参考品检测结果Ct值的CV均在5.0%以内；A、B、C、E 实验室的最低检出限结果均为1 × 103个／ mL，D 和G实验室的最低检出限结果为1 × 102个／ mL，F 实验室的最低检出限为1 × 104个／ mL。见表4。

表3 重复性验证结果（Ct 值）Tab.3 Verification for reproducibility（Ct value）

表4 协作标定结果Tab.4 Results of collaborative calibration

3 讨 论

核酸检测试剂国家参考品对核酸快速诊断试剂盒的质量控制和评价至关重要，是相关产品注册检验、上市审批的重要基础［17-20］。因此，本研究制备了鲍氏不动杆菌核酸检测试剂盒国家参考品。选择20株经鉴定、且具有代表性的病原菌作为参考品菌株，10 株阳性参考品菌株均为鲍氏不动杆菌；10 株阴性参考品菌株的选择，充分考虑了与鲍氏不动杆菌感染部位相同或感染症状相似且常见的其他病原体，以及同属不同种的干扰菌株，包括鲁氏不动杆菌、琼氏不动杆菌、溶血不动杆菌等。

本研究对分装后参考品均匀性进行评估［21-22］，结果显示，阳性参考品、最低检出限参考品和重复性参考品Ct值的CV均＜2.5%，表明参考品分装后均具有良好的均匀度。考虑到参考品在运输、分发、使用过程中，存在反复冻融、保存温度变化等风险，且参考品的稳定性将直接影响相关试剂对结果的判断，本研究对参考品进行了稳定性评估。结果表明，与-20 ℃保存的对照参考品比较，在参考品菌株于2 ～8、25、37 ℃分别放置3、7、14 d 后，以及冻融3、5次后，均具有较好的稳定性，可满足运输及正常的使用要求。最低检出限是评价诊断试剂检测能力的重要指标，是评价诊断试剂检测下限的依据［23］，本实验结果显示，最低检出限为1 × 103个／ mL。重复性参考品用来评价诊断试剂重复检测的稳定性［23］，本研究制备的重复性参考品结果的CV均＜2.5%，显示稳定性良好。

本实验邀请了7 家不同实验室开展了协作标定，全面评估了鲍氏不动杆菌核酸检测试剂盒国家参考品的质量。其中，D 实验室在特异性验证时，未能区分鲍氏不动杆菌同属不同种的菌株，表明本研究选择的阴性参考品能够对一些诊断试剂进行有效干扰。F 实验室的最低检出限结果为1 × 104个／ mL，低于其他实验室的最低检出限，表明其诊断试剂盒的灵敏度相对较低，而D 和G 实验室的最低检出限结果为1×102个／mL，高于其他实验室，D 实验室的诊断试剂盒出现假阳性的情况，表明其特异性较差。上述结果表明，本实验制备的参考品可用于鲍氏不动杆菌核酸检测试剂盒的质量评价。