人用疫苗生产用细胞基质安全性评估现状

王美皓，刘文凯 综述，乔自林，王家敏 审校

1.西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州730030；2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030

从詹纳在挤奶女工手上接种牛痘患者的脓液开始，直至20 世纪初，疫苗的来源主要为受感染的人或动物的组织，以及被感染的血清等，如从兔子、绵羊或山羊中提取的神经组织，哺乳动物的脑等（小鼠、大鼠或兔子）。20 世纪30 年代以后，生产和制造人用、兽用疫苗主要使用鸡胚培育病毒的方法，这种工艺存在许多限制，如生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等。随着病毒对鸡胚的逐渐适应，病毒抗原性发生了改变，一些疫苗种子无法在鸡胚上增殖，因此，从安全性菌株的选择到疫苗产品供应之间需要较长的时间。事实上，在大流行暴发的情况下，更具体地说，在禽流感暴发时，鸡胚供应量会严重不足。据中国动物疫病预防控制中心报告，2020 年初，湖南省发生一起家禽H5N1 亚型高致病性禽流感疫情，养殖户存栏肉鸡7 850 只，发病死亡就已达到4 500 只。可见，传统疫苗工艺不能快速响应疫情并及时有效地提供大量的疫苗剂量。

随着时间的推移，疫苗生产工艺已经取得了重大进展，更安全和更具免疫原性的新型疫苗生产工艺的开发，使疫苗生产商获得了更高的产率。以细胞基质生产病毒性疫苗，对提高产品安全性以及应对日益增长的疫苗需求量和降低相关生产成本具有重要意义。

本文将重点介绍用于生产人用病毒性疫苗的细胞基质的安全性评估，为新型病毒性疫苗的上市提供细胞基质安全性评估的相关参考。

1 细胞基质在疫苗开发中的应用

为克服鸡胚的限制，在疫苗生产的上游工艺中引入了细胞培养技术，比起传统生产工艺，细胞基质的疫苗生产工艺具有更高的灵活性。细胞基质疫苗生产工艺的首次尝试是在1954 年，SALK 等［1-2］使用原代猴肾细胞生产出脊髓灰质炎疫苗，此后一直将原代细胞作为疫苗生产的细胞基质。原代细胞直接来源于动物组织，属于正常细胞，没有DNA 突变及致瘤性，具有广泛的病毒敏感性，但来源不同的原代细胞的质量及敏感性存在差异，且自我增殖能力有限，细胞培养条件严苛，获得的疫苗可能存在潜在的病毒等外源因子的污染问题。因此，基于疫苗安全性的考虑，原代细胞并不作为细胞库存储或者仅在一定程度上有限存储，这都促使生产商积极开发出更适用于疫苗生产的细胞基质。

细胞基质疫苗生产工艺的第二次变革是从原代细胞中获得连续细胞系，即二倍体细胞系和传代细胞系。如人肺来源的MRC-5 和WI-38 细胞［3-4］，是从原代细胞中获得的二倍体细胞系，具有正常或接近正常的核型，与原代细胞相比，可通过鉴定建立细胞种子库进行系统化生产，以保证疫苗生产过程的可控性以及疫苗产品的稳定性。但生产过程难以规模化，对培养液以及血清营养成分的高要求，增加了外源物污染的风险，给疫苗的安全性带来了挑战，且这类细胞增殖能力有限，最终会出现衰老和凋亡。不同于二倍体细胞系，传代细胞系具有无限的自我增殖能力，可以适应现代培养技术，能够通过生物反应器进行高密度大规模生产，如MDCK 细胞和Vero 细胞等［5-6］，但随着细胞的多次传代，遗传修饰可能发生改变，导致细胞出现致瘤性的表型。如在代次高的Vero 细胞系（P162）显示出遗传的不稳定性，并表现出发展成为肿瘤的可能性。因此，仅有低传代的非致瘤性细胞才可以用于疫苗生产，但由于这类细胞的广泛使用，种子库存正在减少。

面对传代细胞系存在的限制，生产商结合基因工程、克隆等分子技术，探索性的建立了专有细胞系，迎来了疫苗生产工艺的第三次飞跃［7］。目前这类细胞系已经作为新型细胞基质应用于特定的生产工艺中，为满足生物制品的监管及安全性的要求已被广泛表征。如基因治疗中腺病毒的生产（PER.C6®细胞系）或流感疫苗的生产等［8］。见表1［9］。

2 生物制品的监管

自第一代疫苗生产以来，监管部门以及公共卫生当局监察的重点一直是细胞成分和可能存在的外源因子，目前已经发现了一些重要的污染来源［10］。如20 世纪60 年代用于生产脊髓灰质炎疫苗的猴肾细胞中发现了猴病毒（SV40）；20 世纪70 年代早期轮状病毒疫苗（Rotarix®和RotaTeq®）中检测出猪圆环病毒序列等［11］。

表1 常见生产用疫苗的细胞基质Tab.1 Common cell substrates for vaccine production

科学技术的进步以及分析方法的完善，已经能够证明存在以前未知或无法检测到的污染物，监管部门也开始实施新的生产和控制策略，并将其指定为指导疫苗生产的药典。药典中详细说明疫苗生产的原材料和起始材料的选择及表征、中间产品和最终产品的控制以及生产过程的设计和验证，现已涉及到疫苗用细胞基质的相关问题，如这类细胞基质通常表现出的致瘤性和成瘤性等。通过定期修订，药典为生产商提供了关于疫苗生产用细胞基质的选择、表征和维护等要求［12］。

首先，生产病毒性疫苗的细胞基质必须具有良好的特征，符合预期的目的，且经过仔细的记录。对于所有类型的细胞，根据生产规范（GMP）和细胞培养规范（GCCP）［13］的一般原则，需要制备主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB），此方案可确保细胞的可靠性和一致性，以及用于生产之前的安全检测。细胞库适合储存在长期稳定的环境中，如液氮或超低温冰箱，并需要定期进行检测，以此保证其表型和基因型的稳定性。

其次，为了保证疫苗制品的安全性，生产商根据国家监管当局的规定以及细胞的特性，规定了用于疫苗生产的细胞检测程序，包括来源、稳定性和增殖性、无菌性以及病毒性的分析等。如核型、同工酶图谱、DNA、生长速率、特定染色体或表面标记等；其中非病毒剂的检测有细菌、真菌、支原体和分枝杆菌等；病毒剂的检测有血凝试验、在不同细胞系中观察细胞病变、物种的体内试验等；逆转录病毒检测有透射电子显微镜（TEM）和生产逆转录病毒（PERT）试验等［14］。此外，必须建立标准操作规程，以降低细胞基质与供体分离后，在细胞基质上进行适应、工程或克隆时外源物污染的风险。人或动物来源的原材料，必须针对潜在污染物进行彻底的记录和分析。建议对来源物种或衍生过程中使用的原材料中的病毒进行化验，如使用化学诱导剂方法检测潜伏病毒（DNA 病毒和内源性逆转录病毒）是否存在［15］。

很多安全性疫苗是由原代细胞和二倍体细胞为基质生产的，监管部门已认定这类细胞的残余DNA无危险性，即使用该细胞基质生产疫苗不存在致瘤性的潜在危险，反观传代细胞，因为调控生长的基因失调才具备了无限增殖的能力，因此理论上认为传代细胞系的DNA 具有使其他细胞生长失控以及产生致瘤性的潜在能力。细胞基质的致瘤性表型可在至少4 个月的观察中通过评估在107、105、103和101cells／animal 的剂量下肿瘤形成的动力学来定义，评估的参数包括50%动物的肿瘤产生剂量（TPD50）、肿瘤发展所需的时间和形成转移的能力等。目前的理解是，较低的TPD50（101～ 104cells ／ animal 时形成肿瘤的能力，包括HeLa 细胞）与肿瘤的诱导发生具有相关性［16］。鉴于随着细胞代次增加，致瘤性概率的相对提高，必须对所有的二倍体细胞系（特征良好的MRC-5 和WI-38 除外）和传代细胞系进行致瘤性评估。

致瘤性细胞是指将完整的细胞注射至遗传免疫缺陷动物后，具有形成肿瘤能力的细胞。使用细胞基质生产疫苗需要进行细胞的致瘤性评估，即必须将细胞DNA（≥100 g）和细胞裂解物（从107个细胞中获得）注射至新生裸鼠、新生仓鼠或新生大鼠中，在至少4 个月的时间内对动物进行检查，寻找形成的结节。在观察期结束时，人道处死动物并检查注射部位结节形成情况及病灶转移情况。

自20 世纪90 年代以来，使用永生化细胞系生产病毒性疫苗是人们一直在讨论的课题［17］。与细胞基质致瘤性相关的主要为诱导同种异体肿瘤移植、转移已知或者未知的病毒以及转移可能引发肿瘤的致癌剂或细胞成分等。目前监管部门认为，制造疫苗的首要安全问题是致瘤细胞系或来源于肿瘤的细胞系中的细胞DNA 和外源因子。因此，需要在生产过程中对细胞基质中的外源因子及细胞DNA进行清除。

3 生 产

生产过程中细胞基质的选择对疫苗制品的安全性以及稳定性均有很大的影响。由于部分细胞基质有可能本身携带内源性病毒或外界污染的病毒，若无法保证生产过程的绝对安全，通过细胞基质生产的疫苗也会含有污染的病毒，这直接影响疫苗制品的安全性。细胞基质的敏感性直接影响疫苗生产的产量，只有进行规模化的稳定生产，才能保证使用该细胞基质生产的疫苗能够真正起到预防传染性疾病的作用。因此，细胞基质的敏感性评价不仅要监控病毒在细胞基质上适应的全过程，更要评估疫苗制品生产的可行性。此外，在细胞培养的过程中，应尽可能接种少量的病毒，但尽可能多的收获病毒液，同时为了在降低成本的前提下达到高生产性能，必须考虑以下几个方面。

3.1 用于病毒生产的细胞基质的培养 许多疫苗生产工艺均是在转瓶或者细胞工厂中培养贴壁细胞系进行的。由于成本、占用楼层和劳动力等限制，这些技术无法扩大培养［18］。虽然，固定床表面系统等新的替代方案有稍许改进［19-20］，但贴壁细胞大规模生产主要是依靠搅拌式生物反应器中的微载体系统。在这个控制良好的悬浮培养系统中，随着微载体表面积与生物反应器体积的增加，细胞得以扩大培养，并且操作简单，劳动强度低。然而，微载体细胞培养系统仍然是一个具有挑战性的技术，即在扩大培养的过程中伴随着昂贵和繁琐的细胞分离操作［21］。因此，随着科技的进步，开发出MDCK、PER.C6®、EB66®或AGE1.CR®等悬浮细胞系，能够实现无微载体培养，有效解决贴壁细胞培养中面临的许多安全性问题，提高细胞培养过程中的成本效益、可操作性及安全性［22］。如2012 年Novartis 公司利用悬浮MDCK细胞大规模生产流感疫苗Optaflu ／Flucelvax（三价），该疫苗在欧盟及美国已获准上市。同年，MedImmune公司以悬浮MDCK 细胞大规模生产流感疫苗Flumist（四价），已在美国获准上市。

每种细胞基质均有其自身的自然属性和特性，包括细胞的营养需求、代谢控制、剪切敏感性、需氧量、遗传稳定性、代谢副产物、最佳温度、pH 值、渗透压等。因此，培养基的优化在整个工艺流程中起着至关重要的作用，其不仅可确保细胞的高密度生长，还能够提高病毒的产毒量。疫苗生产的培养基中大多含有胎牛血清（FBS），FBS 存在批间差，经常导致生产工艺的不稳定［23］，并且FBS 作为外源因子，导致疫苗制品存在较大的安全性隐患，这就促使生产商将培养基的优化方向转为无动物成分的细胞培养基和细胞特异性培养基的开发及生产［24-26］。通常情况下，培养基的开发和生产会外包给专门的培养基供应商，而培养基供应商的目标则是选择出达到生产力目标、符合GMP 的质量和监管要求的最佳培养基配方，在保证安全性的前提下满足疫苗生产过程中对培养基的需求。

3.2 病毒纯化 经过生产商的不断探索，病毒在细胞基质上的产量得到了显著提高。相比之下，由于严格的监管规则，病毒回收率通常较低，且生产过程中存在的细胞残留蛋白属于异源蛋白，很可能会引发机体的过敏反应，在使用传代细胞生产疫苗时，应进行分离纯化，尽可能去除异源蛋白，并进行纯化工艺的验证，以保证疫苗制品的安全性。

细胞基质用于疫苗生产，必须考虑到病毒与其他可传播因子、细胞DNA 和促生长蛋白等对疫苗安全性带来的影响。但目前对异源蛋白的检测手段仍不完善，仍以疫苗的蛋白总量进行间接质控。事实上，许多纯化步骤是必要的，从细胞裂解，通过宏观和微过滤去除细胞碎片，浓缩和酶解，层析或区带离心纯化，再到使用纳滤杀菌。为了符合药典要求，对需纯化的物质的分析必须包括无菌、产品特性和效力，以及生产过程残留物的定量，如牛血清白蛋白、抗生素、苯甲酶、HCD 和蛋白质等。然而这种操作过程不仅引发病毒颗粒的重大损失，且占主要的生产成本消耗［27-28］。为了获得更高的病毒产率，生产商不断尝试新的纯化技术。目前，病毒产率已经成为疫苗生产领域技术诀窍中非常重要的一部分。

4 展 望

生物制品的质量控制不仅指对最终产品的质量控制，更包括对整个生产过程的质量控制，包括原材料、中间产品、最终产品及生产过程的质量控制等。细胞基质作为疫苗生产的主要原材料，其质量的优劣直接影响疫苗的质量和产量以及疫苗的安全性。细胞基质生产疫苗时，焦点在于可能存在的外源因子污染和某些情况下细胞本身的特性，以及细胞培养中各个环节的操作。这些均推动疫苗行业在保证安全性的前提下，向更高的反应性、灵活性和降低运营成本的方向发展，以确保经济的可持续性。怎样以一种较智能的方式生产疫苗，同时保持对生产高质量产品的坚定承诺［29］，这是新时代疫苗生产工艺面临的巨大挑战。

目前，疫苗生产中的相关设施可以快速地建立和调试，使用模块化设施替代运营复杂、成本高昂、产品周期长的不锈钢设施，相对地减少资本和运营支出［30］，这些改进使得各种生物制品在给定空间内生产成为可能。整合上游和下游的全连续加工模式，预计将提供比传统批量生产战略更高的效益。这种能够快速高效且以低成本运营的生产工艺，由于培养基营养始终保持恒定，有毒副产品被有效排放，工艺之间无停顿，可以提供更高的产品收获率，并且能够更好地解决疫苗生产过程中存在的安全性隐患。

随着行业中疫苗生产的趋势从以鸡胚为基础的传统生产工艺转向以细胞基质为基础的疫苗生产工艺，但鉴于目前仍然仅有相对较少数量的细胞基质这一事实，建立和验证新的疫苗用细胞基质引起了生产商的关注。因此，安全细胞基质的多样性保证了现在和未来的高标准疫苗供应。

综上所述，疫苗用细胞基质的理想特征是其应该对多数病毒敏感，能够在短时间内无限增殖到高细胞密度，并易于放大，能够达到较高的安全性评估标准。此外，由于细胞基质是疫苗制品的重要组成部分，因此必须根据许多不断完善的安全性和法规要求对其进行广泛表征，在选择开发新疫苗的细胞基质前，要多方面考虑。需要强调的是，当前没有任何细胞基质满足所有的标准，仅能在保证疫苗安全性的前提下考虑和评价不同的细胞基质，为每个新疫苗选择最优的细胞基质。