盐度对凡纳滨对虾血细胞吞噬与免疫相关因子基因表达的影响

展文豪，周书洪，袁春营，崔青曼

（1.天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457；2.天津市滨海新区塘沽水产技术推广站，天津 300450）

凡纳滨对虾（南美白对虾）Litopenaeus vannamei原产于美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘鲁北部至墨西哥湾沿岸，以厄瓜多尔沿岸分布最为集中，是世界水产养殖产量最高的虾类之一，我国大部分地区均有养殖[1]。盐度是影响南美白对虾渗透压调节的重要因素，显著影响其增长率、成活率和饲料系数[2]。海水养殖的凡纳滨对虾肝胰腺胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力普遍高于淡水养殖的凡纳滨对虾[3]。高盐能显著抑制南美白对虾仔虾的日增重和存活率，对虾的总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性随盐度升高均呈现出先升高后降低的趋势，盐度50 时达到峰值，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性随盐度升高而上升[4]。低盐度下南美白对虾的酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶和呼吸爆发活性降低[5]。为了更好地掌握盐度对凡纳滨对虾免疫功能的影响机制，本研究探讨了盐度对凡纳滨对虾血细胞吞噬能力和免疫相关因子基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

凡纳滨对虾购自天津市宝坻区渔翁水产科技发展有限公司，体长（7.01±0.86）cm，体质量（3.15±1.03）g。鳗弧菌Vibrio anguillarum 由天津市水产研究所赠送。

实验饲料购自天津凯源饲料有限公司，粒径为1.0 mm，粗蛋白质38.12%、粗脂肪7.03%、粗纤维4.26%、粗灰分9.87%、钙2.36%、磷1.41%。

TRIzolTM Reagent试剂盒、M-MLV、Random Primer 及Oligo dT 购自Invitrogen Corporation；RNase inhibitor 及dNTPs 购自上海生工生物工程技术服务有限公司；氯仿、异丙醇及乙醇购自北京索莱宝科技有限公司。Bioprep-6 生物样品均质仪，杭州奥盛仪器有限公司生产；立式蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；PCR 扩增仪和Gel Doc EZ Imager 凝胶成像系统，美国伯乐公司生产；MIKRO 200R 和UNIVERSAL 320R 台式冷冻离心机，德国Hettich 科学仪器公司生产；精密pH 计，天津市盛邦科学仪器技术公司生产；电子分析天平，梅特勒-托利多公司（瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 实验设计与饲养管理

凡纳滨对虾饲养在730 mm×530 mm×450 mm水族箱中，每箱中30 只对虾，设置3 个盐度梯度（6、18 和30），每组3 个重复，共计9 个处理组。

实验持续6 周。按对虾体质量的4%～5%、每天6:00、11:00、16:00 和21:00 投喂4 次，每次投喂量占日总投喂量的30%、20%、30%和20%。饲养期间连续充气，水温27～29 ℃，pH7.8～8.1，溶解氧＞6 mg/L。

1.2.2 凡纳滨对虾血细胞吞噬活性测定

（1）按照文献[6]采集血淋巴细胞。

（2）荧光标记及血细胞吞噬：1 mL 鳗弧菌菌悬液（106CFU/mL）中加入20 μL FITC（1 mg/mL）进行荧光标记16 h，后续步骤按照文献[6]进行。细胞吞噬活性用吞噬百分率表示：吞噬百分率（%）=（吞噬细菌的细胞数/细胞总数）×100%。

表1 实验用的引物序列[6,7]Tab.1 Sequences of the primers used in the experiment

1.2.3 实时定量PCR 分析免疫因子基因表达

血细胞、肝胰腺和鳃组织总RNA 提取按照Trizol 总RNA 抽提试剂盒说明书进行。18S rRNA（内参）、酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、过氧化氢酶（CAT）、TLR（Toll 样受体）、免疫缺陷基因（IMD）的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其序列见表1。

本实验用实时荧光定量PCR 反应体系与反应程序见文献[6]。

1.3 数据处理

实验数据以mean±SD 表示，采用SPSS 22.0 软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 盐度对凡纳滨对虾血细胞吞噬活性的影响

由图1～图4 可知：盐度30 和18 组凡纳滨对虾血细胞吞噬活性均显著高于盐度6 组对虾（P＜0.05），盐度18 组凡纳滨对虾血细胞吞噬活性明显高于盐度30 组，但没有显著性差异（P＞0.05）。

2.2 盐度对凡纳滨对虾免疫相关因子基因表达的影响

图1 盐度6 组凡纳滨对虾血细胞的吞噬图Fig.1 Phagocytosis of blood cells of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei exposed to a salinity of 6

图2 盐度18 组凡纳滨对虾血细胞吞噬图Fig.2 Blood cell phagocytosis of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in the salinity 18 group

图3 盐度30 组凡纳滨对虾血细胞吞噬图Fig.3 Blood cell phagocytosis of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in the salinity 30 group

图4 不同盐度组凡纳滨对虾血细胞吞噬活性比较Fig.4 Comparison of blood cell phagocytic activity of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in different salinity groups

由表2、3、4 可知，盐度30 组凡纳滨对虾肝胰腺组织中TLR、IMD、PO、CAT 及LZM 基因表达水平显著高于盐度6 组（P＜0.05）；盐度18 组凡纳滨对虾肝胰腺组织中TLR、IMD、PO、CAT、LZM 及SOD基因表达水平显著高于盐度6 组（P＜0.05）；盐度30组对虾肝胰腺组织中的TLR、IMD、PO 基因表达水平显著低于盐度18 组（P＜0.05）；盐度30 组凡纳滨对虾血细胞中TLR、SOD 及LZM 基因表达水平显著高于盐度6 组（P＜0.05）；盐度18 组凡纳滨对虾血细胞中TLR、IMD、PO、SOD 及LZM 基因表达显著高于盐度6 组（P＜0.05）；盐度30 组对虾的TLR 基因表达水平显著高于盐度18 组（P＜0.05），而盐度30 组对虾的PO 基因表达水平显著低于盐度18 组（P＜0.05）；盐度30 组凡纳滨对虾鳃组织中TLR 和CAT 基因表达水平显著高于盐度6 组对虾（P＜0.05）；盐度18 组凡纳滨对虾鳃组织中CAT 和LZM 基因表达水平显著高于盐度6 组（P＜0.05）；盐度30 组对虾鳃组织中的TLR 基因表达水平显著高于盐度18 组（P＜0.05），而盐度30 组对虾的CAT 基因表达水平显著低于盐度18 组（P＜0.05）；其他因子基因表达水平没有显著性差异。

3 讨论

3.1 盐度对凡纳滨对虾血细胞吞噬活性的影响

对虾免疫系统主要包括细胞免疫和体液免疫，细胞免疫主要指凋亡、封装、吞噬和结节的形成[8]。本研究发现，不同盐度下，南美白对虾血细胞对鳗弧菌的吞噬率明显不同，盐度18 组对虾血细胞的吞噬率最大，盐度6 组最小。

3.2 盐度对南美白对虾免疫相关因子基因表达的影响

盐度是影响甲壳动物非特异性免疫的重要生态因子。长期低盐胁迫时，凡纳滨对虾肝胰腺差异表达cDNA 文库中62.5%的免疫相关基因下调表达[8]；高盐显著影响凡纳滨对虾的免疫相关酶活力，对不同组织中免疫酶活力的影响存在一定的组织特异性，50 以上的高盐胁迫对对虾免疫相关酶活力的影响尤为显著[9]。

Toll 和IMD 信号传导途径是虾体中调节先天免疫的重要免疫信号传导系统[10]。Toll 通路由Toll样受体（Toll like receptor，TLR）及其下游效应因子如MyD88、TRIF、TRAM 和TRAF 等组成，机体内的过氧化可以产生TLR 的内源性配体，激活TLR[11,12]。IMD（免疫缺陷基因）途径是对虾的另一个重要免疫识别信号传导通路，Toll 途径响应革兰氏阳性细菌和真菌的刺激，IMD 途径则响应革兰氏阴性细菌的入侵[11]。本研究发现，对虾Toll 样受体（TLR）基因和IMD 基因表达存在组织特异性。TLR 基因在对虾肝胰腺和血细胞中表达较强，在鳃中较弱，且受盐度影响较大。盐度30 和18 组对虾肝胰腺和血细胞中的TLR 基因表达水平显著高于盐度6 组，盐度30组对虾鳃中的TLR 基因表达水平显著高于盐度6组；IMD 基因在对虾肝胰腺中表达较强，在鳃和血细胞中较弱，且盐度30 和18 组对虾肝胰腺中的IMD 基因表达水平显著高于盐度6 组。

表2 盐度对凡纳滨对虾肝胰腺免疫相关因子基因表达的影响Tab.2 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表3 盐度对凡纳滨对虾血细胞免疫相关因子基因表达的影响Tab.3 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in blood cells of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表4 盐度对凡纳滨对虾鳃免疫相关因子基因表达的影响Tab.4 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in gills of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

酚氧化酶以酶原形式存在于甲壳动物血细胞中，血细胞受刺激后将该酶原释放到血淋巴中，并被激活。它与血细胞的吞噬、包囊以及血淋巴的抗菌活性和外源物质的识别有关[13]。对虾的酚氧化酶主要存在于大颗粒血细胞中，约占75%，小颗粒血细胞中仅有25%。透明细胞主要具有吞噬功能[14]。盐度20 组凡纳滨对虾血细胞总数和血清酚氧化酶活力显著高于盐度5 组[15]。本研究中的酚氧化酶基因表达水平以对虾肝胰腺最高，且盐度30 和18 组对虾肝胰腺中的PO 基因表达水平显著高于盐度6组。

超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是机体内重要的抗氧化酶，二者相互作用可以清除细胞内产生的过量氧自由基，对机体具有重要保护作用。本研究发现，不同组织中SOD 和CAT 基因表达差异较大，SOD 基因表达以对虾血细胞最强，CAT基因表达以对虾鳃组织最强，肝胰腺次之，血细胞最弱。盐度对SOD 和CAT 基因的表达影响较大，盐度30 和18 组对虾血细胞中的SOD 基因表达水平显著高于盐度6 组，盐度30 和18 组对虾肝胰腺和血细胞中的CAT 基因表达水平显著高于盐度6 组。

溶菌酶（LZM）是一种碱性蛋白，广泛存在于体内多种组织和体液中，是非特异性免疫系统的主要成分，在甲壳动物的免疫中起重要作用[16]。研究发现，盐度30 和18 组对虾肝胰腺和血细胞中的LZM基因表达水平显著高于盐度6 组，盐度18 组对虾鳃组织中的LZM 基因表达水平显著高于盐度6 组。

综上，环境盐度变化可能通过影响凡纳滨对虾各组织的抗氧化能力、溶菌活性、识别能力和血细胞吞噬活性等，调控凡纳滨对虾细胞免疫和体液免疫。