黄颡鱼(♀)、长吻(♂)及其杂交F1代遗传多样性分析

王宏玉，武兆文，付东勇，苏孟园，杨汶珊，唐荣叶，王 涛，尹绍武

(南京师范大学 海洋科学与工程学院，江苏省特色水产育种与绿色高效养殖技术工程研究中心，江苏 南京 210023)

微卫星DNA也称简单串联重复序列(SSRs)，由非常短的串联重复DNA片段组成，是广泛分布于真核生物基因组中的一种中度重复序列[7]。微卫星DNA有着高突变率、中性、共显性，及在真核基因组中普遍存在等特点[8]，相比于其他分子标记手段有着明显的优势，能成功地用于揭示群体遗传分析[9]，进行种质资源及亲缘关系的鉴定和遗传连锁图谱绘制[10]。微卫星DNA在鱼类中的应用进展非常快，到目前为止，鱼类杂交后代的遗传分析也都普遍使用微卫星DNA技术，已有学者对黄颡鱼(♀)×瓦氏黄颡鱼(P.vachelli)(♂)[11]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)(♀)×萨罗罗非鱼(Sarotherodonmelanotheron)(♂)[12]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)(♀)×翘嘴鲌(Culteralburnus)(♂)[13]等进行亲本与子代的分析。笔者采用微卫星分子标记技术，寻找能够鉴定黄颡鱼、长吻及杂交F1代3个群体的特异性微卫星分子标记并进行遗传多样性分析，在分子水平上探索双亲与子代的遗传规律，为实现杂交鲿科鱼类新品种选育提供基础资料和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

使用上海捷瑞生物公司的细胞(组织)基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，取黄颡鱼、长吻、杂交F1代的尾鳍各约0.5 g，进行DNA提取，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性与纯度，置于冰箱-20 ℃保存，待使用时取出。

1.2.2 微卫星引物的筛选

表1 在3个群体中表达的12个微卫星位点的特征Tab.1 Features of 12 microsatellite loci expressed in 3 populations

1.2.3 PCR扩增

PCR扩增参照文献[14]的设计。反应总体系为20 μL，包括：DNA模板1 μL，正、反引物各0.8 μL，灭菌水7.4 μL，2×Taq Master Mix 10 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；35个循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，退火30 s(每个位点退火温度见表1)，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪中观察是否有单一的条带。将检测到有单一条带的产物上样于ABI3500xl基因分析仪进行毛细管电泳，利用软件GeneMapper 4.1分析微卫星位点的片段大小。

1.2.4 数据处理

数据处理参考文献[15]。利用POPGENE 1.32分析微卫星位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、遗传相似度、Nei氏遗传距离；利用PIC-CALC计算多态信息含量值(PIC)。利用MEGA 5.0构建非加权组平均法3个群体的UPGMA的亲缘关系树。

2 结果与分析

2.1 有效引物筛选

自每个群体的32个DNA样品中选取5个，用来验证所筛选的20对引物，所得条带见图1。经验证后共有12对能在黄颡鱼、长吻及其杂交子代中扩增出清晰条带(图2)。其中双碱基引物10个、三碱基引物1个、四碱基引物1个，产物大小211～310 bp，每种引物扩增出的多态性位点差别不大。

图1 筛选出的能在3个群体中表达的引物Fig.1 Primers screened for expression in three populations前5个为黄颡鱼，中间5个为长吻，后5个为杂交F1代.The first five bands are yellow catfish P.fulvidraco,the middle five ones are longsnout catfish L.longirostris,and the last five ones are hybrids F1.

图2 同一引物在3个群体中的表达情况Fig.2 Expression of the same primer in three populationsa.杂交F1代；b.长吻；c.黄颡鱼a.Hybrid F1;b.longsnout catfish L.longirostris;c.yellow catfish P.fulvidraco.

2.2 3个群体遗传特性分析

杂交F1代的平均有效等位基因数为2.535，高于黄颡鱼(2.382)和长吻(2.221)(表2)。黄颡鱼的平均观测杂合度(0.419)高于长吻的平均观测杂合度(0.367)，而杂交F1代的平均有效观测杂合度(0.604)也比双亲高。杂交F1代的平均多态信息含量为0.509，黄颡鱼为0.420、长吻为0.365。

表2 黄颡鱼、长吻、杂交F1代的遗传多样性参数Tab.2 Parameters of genetic diversity in yellow catfish P.fulvidraco,longsnout catfish L.longirostris and hybrid F1

表2 黄颡鱼、长吻、杂交F1代的遗传多样性参数Tab.2 Parameters of genetic diversity in yellow catfish P.fulvidraco,longsnout catfish L.longirostris and hybrid F1

位点Locus黄颡鱼P.fulvidraco长吻L.longirostris杂交F1代HybridF1NaNeHoHePICNaNeHoHePICNaNeHoHePICL1931.0990.0940.0920.08811.0000.0000.0000.00022.0001.0000.5080.375L2521.9520.8440.4960.36941.1000.0630.0920.08993.7440.8750.7450.698L3353.7790.7810.7470.68721.9090.5310.4840.36342.2530.1250.5650.458L35106.0770.5940.8490.81765.1070.5940.8170.775113.5620.9690.7310.703L3972.4980.2500.6090.57784.3570.7810.7830.73632.4300.2190.5980.501L4151.8430.0630.4650.43032.1810.6560.5500.61821.9980.9690.5070.375L4332.1810.8440.5500.45731.5340.3130.3540.45742.4180.0940.5960.506L4431.2900.1880.2280.21021.0640.0000.0620.05932.2530.6560.5650.481L4572.7420.2190.6450.56811.0000.0000.0000.000132.9130.8750.6670.639L4762.1200.6250.5370.44421.1680.1560.1460.13742.1810.0310.5500.439L5432.0020.5310.5080.39084.1290.6560.7700.72232.7130.7190.6410.560L7711.0000.0000.0000.0004.2.1010.6560.5320.42921.9520.7190.4960.369均值Mean4.5832.3820.4190.4770.4203.6672.2210.3670.3830.3655.0002.5350.6040.5970.509

注：Na.等位基因数；Ne.有效等位基因数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度；PIC.多态信息含量.Note：Na.number of allele；Ne.number of effective allele；Ho.observed heterozygosity；He.expected heterozygosity；PIC.polymorphic information content.

2.3 群体间遗传距离和遗传系数分析

表3 3个群体的遗传距离和遗传相似系数Tab.3 Genetic distance and genetic similarity coefficient of three populations

基于Nei氏遗传距离，用MGEA 5.0软件构建的UPGMA树显示，杂交F1代与父本长吻亲缘关系最近，先聚为一支，然后再与母本黄颡鱼聚为一支(图3)。

图3 黄颡鱼、长吻和杂交F1的UPGMA聚类分析Fig.3 UPGAM molecular trees of yellow catfish P.fulvidraco,long-snout catfish L.longirostris and hybrid F1 based on genetic distance

3 讨 论

3.1 3个群体的遗传多样性

生物的遗传多样性是评价生物资源状况的一个重要依据[16]。微卫星DNA标记是进行物种亲缘关系研究及遗传多样性分析的有效工具，是分子水平上研究遗传多样性的一个重要手段[17]。微卫星DNA凭借较高的突变率使得微卫星具有高度的遗传多态性，在鉴定种群内的亲缘关系以及近亲自交程度等均有着较为普遍的应用[18]。彭涛等[19]曾利用12对湖鲟(Acipenserfulvescens)微卫星引物对小体鲟(A.ruthenus)、施氏鲟(A.schrenckii)、西伯利亚鲟(A.baeri)及3种鲟鱼杂交后代的引物通用性进行研究，结果显示，只有4对引物在6种鲟鱼中表现出多态性，用来分析遗传多样性。唐江等[20]从50对石斑鱼属(Epinephelus)微卫星引物中筛出27对引物，用来分析鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)(♂)、云纹石斑鱼(E.moara)(♀)及其杂交子一代云龙斑的遗传性状，最终有25对引物在子代中检测出多态性。本试验通过一步筛选，最终从20对引物中筛选出12对具有多态性位点，有效扩增率为60%。

有效等位基因数是基因纯合度的倒数，反映了等位基因间的相互影响，可作为群体遗传变异的一个指标[21]。根据12对有效扩增结果显示，黄颡鱼、长吻及杂交F1代的平均有效等位基因数为2.382、2.221、2.535。有效基因数的增加证明了在杂交子代保持较高的遗传潜力。由表2可知，杂交F1代的平均观测杂合度和平均期望杂合度为0.604、0.597，略高于母本黄颡鱼(0.419、0.477)，明显高于父本长吻(0.367、0.383)。杂合度又称基因多样性，是测量群体遗传变异的最佳参数[22]。通过检测位点上杂合子基因型占据该位点所有基因型的比例，能够反映群体间的遗传变异高低[23]。而且有效基因数、观测杂合度、期望杂合度三者数值越大，基因丰富度就越高。杂交F1代的基因杂合度都高于双亲，基于等位基因变异有较高的遗传多样性，这是杂种优势得以形成的重要遗传物质基础之一。以Botstein等[24]提出的用多态信息含量来衡量基因变异程度高低为依据，当多态信息含量≥0.5时为高度多态，0.25<多态信息含量<0.5时为中度多态，多态信息含量≤0.25时为低度多态。由表2可知，黄颡鱼和长吻的多态信息含量为0.420和0.365，为中度多态，杂交F1代为0.509大于0.5为高度多态，杂交F1代的多态信息含量高于双亲。这个结果表明，在所筛选到的引物中，杂交F1代呈现出比亲本高的变异程度，这与李景芬等[25]研究黄颡鱼(♀)×瓦氏黄颡鱼(♂)得出的杂种一代基因变异程度比双亲高，DNA多态性丰富，以及在红鳍东方鲀(Takifugurubripes)(♀)、菊黄东方鲀(T.flavidus)(♂)及其杂交子代遗传分析结果显示的子代遗传多样性高于双亲[26]的结论是一致的。这些都体现出杂交F1代较双亲的遗传多样性有所增加，具有一定的杂交优势，可以有培育的潜力。

3.2 遗传距离和遗传相似指数

在以往的研究结果中不难发现，杂种优势与遗传距离存在着正相关性[12]，亲本间遗传差异越大，亲缘关系越远，其后代杂种优势越明显[14]。由Nei氏遗传距离(表3)可知，黄颡鱼和长吻存在着2.0316的杂交距离，说明杂交F1代应该具有一定的杂交优势。UPGMA聚类分析结果表明，杂交F1代与父本长吻的遗传距离(0.8551)小于与母本黄颡鱼的遗传距离(1.7271)，说明子代与父本的遗传差异小于与母本的遗传差异，与父本的亲缘关系较近，从父本获得更多的遗传物质。

4 结 论