泪液特异性IgA检测诊断单纯疱疹病毒性角膜炎的初步研究△

王朱健 黄霏霏 龚一帆 汤荔 曹文俊 张朝然

(1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院检验科 上海 200031；2. 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是当今世界上危害最严重的感染性眼病之一，由单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)感染所引起，因其致盲的病例数可占角膜病致盲的63.2%，而且近年来由于抗生素、激素及其他免疫抑制剂的广泛应用，其发病率呈逐年上升的趋势[1-2]。目前临床上对HSK主要还是依靠病史、典型症状和角膜病变的形态特征来进行诊断，但HSK的临床表现复杂多样，常不典型，与其他一些角膜炎相混淆，容易造成误诊或漏诊。因此需要一种无创、快速、灵敏、经济的检测方法来为HSK提供实验室辅助诊断。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测泪液中HSV DNA来诊断HSK国内外已有报道[3-5]，然而阳性率并不高，且容易受HSK临床类型及抗病毒治疗影响，需要泪液HSV特异性抗体检测作为补充。目前泪液HSV特异性抗体的研究较少，且缺少临床判断标准及系统性的诊断性能评估。我们检测了105例HSK患者泪液中的HSV特异性免疫球蛋白A(HSV-IgA)浓度，评估泪液HSV-IgA检测对HSK诊断的临床价值。

1 资料与方法

1.1 资料 病例组泪液标本来自2013年9月～2019年3月本院就诊患者，其中临床诊断为单眼HSK患者105例，成功收集患眼泪液标本105份(作为患眼组)，健眼泪液89份(作为健眼组)。在HSK患者中根据患眼角膜上皮荧光染色情况又分为上皮染色组(77例)及上皮完好组(28例)。另收集73例患有其他眼表疾病(睑缘炎相关性角结膜病变、真菌性角膜炎、角膜白斑、翼状胬肉等)的泪液73份，作为对照组。所有患者进入研究队列前了解本研究的过程和目的，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 泪液的采集与保存 用直径0.5 mm的聚乙烯塑料毛细管置于下穹隆部结膜囊，利用虹吸作用采得双眼泪液5～20 μL，分别打入eppendorf管，放置-80 ℃冰箱保存待检。

1.2.2 酶联免疫吸附试验 HSV-IgA检测试剂盒购自Virion/ Serion (德国)酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay， ELISA) classic，试验严格按照试剂说明书进行操作。泪液中的HSV-IgA水平以试验结果的OD值根据试剂盒提供的标准曲线计算得出，单位为U/mL。

1.2.3 主要仪器 TECAN sunrise酶标仪(TECAN公司，瑞士)。

1.3 统计学处理 应用MedCalc 15.8统计软件进行数据处理和分析，采用Kolmogorov-Smirnov 法对数据进行正态性检验，并使用Mann-Whitney U 非参数检验比较2组间差异，2组间分类变量比较采用四格表χ2检验，通过受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC 曲线)对检测指标进行诊断性能分析。P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

105例HSK患者，年龄8～83岁，平均年龄53岁，中位年龄57岁，其中男性72例、女性33例；73例对照组年龄7～74岁，平均年龄43岁，中位年龄46岁，其中男性42例、女性31例。病例与对照组间年龄(Z=1.308，P=0.190 9)和性别(χ2=1.824，P=0.176 8)差异均无统计学意义。

HSK患者患眼、健眼以及对照组的泪液HSV-IgA水平比较及检测结果见表1。患眼组泪液中的HSV-IgA水平要明显高于对照组，差异有统计学意义(Z=6.521，P＜0.000 1)，也显著高于健眼组(Z=5.226，P＜0.000 1)。健眼组泪液HSV-IgA水平与对照组相比差异无统计学意义(Z=1.317，P=0.1880 )。

泪液HSV-IgA的ROC曲线分析见图1。通过ROC曲线分析，当泪液HSV-IgA临床判断值为9 U/mL时，可获得最大约登指数0.573 1，敏感度为72.38%，特异度为84.93%，曲 线 下 面 积(area under curve，AUC)为0.788(P＜0.000 1，95%CI:0.720～ 0.845)。

表1 患者患眼、健眼、对照组泪液中HSV-IgA的检测结果

图1 HSK患者泪液HSV-IgA的ROC曲线

HSK患者按角膜上皮完整性分为上皮完好组及上皮染色组2组，上皮染色组HSV-IgA水平为(182.78±636.36)U/mL，明显高于上皮完好组的(21.33± 31.18)，差异有统计学意义(Z=3.000，P=0.002 7)。以＞9 U/mL作为阳性判断值，上皮染色组阳性率为77.92%，上皮完好组阳性率为57.14%，经χ2检验阳性率差异无统计学意义(χ2=3.456，P=0.063 0)。上皮染色组的阳性预测值(positive predict value，PPV)及阴性预测值(negative predict value，NPV)分别为84.51%和78.48%，而上皮完好组的PPV及NPV分别为59.26%和83.78%。上皮完好及上皮染色的2类HSK分别进行ROC分析，获得最优临床判断值均为9 U/mL，曲线下面积分别为0.664和0.833。

3 讨论

角膜上皮刮片进行病毒分离培养是HSV检测的金标准，但细胞培养费时、费事，角膜刮片取材困难且有风险，故在临床应用上受到限制。随着现代分子生物学及免疫学检测技术的发展，泪液检测逐渐成为辅助眼表疾病诊疗的有效方法，具有采样安全、操作简便、患者依从性好、可多次采集、便于随访等优点。HSK患者角膜上皮中的HSV可复制并释放到泪液中，泪腺中的浆细胞受HSV刺激可合成大量的抗HSV的IgA，在发作的3～5 d内达到峰值，产生的IgA通过上皮细胞的免疫球蛋白受体分泌到泪液中，构成了眼免疫中一个非常重要的抗感染机制[6]。Pedersen等[7]最早提出泪液中的HSV-IgA可作为HSK一个诊断参考指标，随后的研究[8-11]报道也支持泪液的HSV-IgA检测在HSK中的诊断价值。

Shoji等[9]采用Schirmer试纸条法采集泪液检测HSVsIgA，灵敏度和特异度分别为49.2%和82.6%。我们的检测方法灵敏度为72.38%，特异度为84.93%，灵敏度要稍高于Shoji等的结果，可能与泪液采集及处理方法、阳性判断值的选择、病例数或病例的临床类型有关。Schirmer试纸和毛细管采集泪液以及样本保存和处理方法对检测结果的影响有待于我们后续的研究结果。ROC曲线显示AUC为0.788，说明通过检测泪液中HSV-IgA的水平可有效区别HSK及非HSK角膜炎。泪液中HSV-IgA的显著升高可高度提示HSK风险，为HSK的诊断及鉴别诊断提供依据。我们通过HSK病例及对照病例的ROC曲线分析得出泪液中HSV-IgA的最优临床界定值为9 U/mL，可为后续临床快速诊断试纸条的研发提供参考。此外，泪液HSV-IgA的检测经济、简便，也更适合在临床推广应用。

本研究结果的特异度为84.93%，即对照组有15.07%比例的眼表现泪液HSV-IgA阳性，这些眼中的HSV-IgA可能来源于外周血。有研究[10]显示泪液中的HSV-IgA水平与血清HSV-IgA水平存在着正相关，可能与M细胞的转运有关。当外周血中存在着较高的HSV-IgA浓度时，则有可能引起泪液中IgA的相应增高，从而影响泪液HSV-IgA诊断性能。如何通过泪液/血清的比例校正公式来判断泪液中HSV-IgA的局部增生，进一步提高诊断效率也是需要研究的问题。

试验结果中上皮染色组的HSV-IgA要显著高于上皮完好组，说明上皮损伤的HSK有更强烈的局部黏膜免疫反应，可能是由于上皮损伤的角膜中存在着更活跃的病毒复制，产生更多的病毒抗原刺激泪腺分泌IgA。这提示泪液中HSV-IgA这一指标不仅能用于诊断，抗体水平的高低可能与疾病进展、预后相关，对HSK疗效及复发预测的临床价值有待更多病例及时间随访观察。