血清HBV RNA在慢性乙型肝炎核苷(酸)类似物治疗停药中的作用

王扬 郑素军 段钟平

核苷(酸)类似物(NAs)作用于HBV聚合酶区，抑制HBV复制，广泛应用于慢性乙型肝炎(CHB)的抗病毒治疗，长期治疗可以改善肝脏组织学病变并降低肝癌发生风险。但是，由于cccDNA在感染肝细胞核内的持续存在，HBV感染并不能被完全清除[1]。然而，相关研究表明[2]，NAs长期治疗可能减少含pgRNA的衣壳进入肝细胞核对cccDNA储存库进行补充，cccDNA会逐步耗竭，NAs每治疗一年可能使cccDNA定量下降约1 log值，因此长期治疗最终实现停药具有理论可行性。临床实践中，部分患者停药后发生病毒反弹，监测cccDNA水平可以为NAs安全停药提供有益的帮助。但是，一方面由于肝组织活检的侵袭性，肝内cccDNA定量检测作为常规检测并不现实，另一方面，cccDNA检测缺乏标准化的量化方法，而且操作过程复杂繁琐，因此有必要开发无创性的替代标记物来监测cccDNA的数量或活性。越来越多的研究表明，血清HBV RNA可以作为反映cccDNA转录活性的一个新的生物标记物，尤其在HBV DNA检测不出的CHB患者更是彰显了其优越性。本文就血清HBV RNA在CHB患者NAs治疗停药中的潜在应用价值作一综述。

一、HBV RNA在病毒生命周期中的来源及功能

HBV生命周期开始于病毒与肝细胞表面牛磺胆酸钠协同转运多肽(NTCP)受体结合，将含有松弛环状DNA(viral relaxed circular DNA, rcDNA)的核衣壳释放到肝细胞内，rcDNA进一步被运输到细胞核，进而被转化成核小体修饰的cccDNA。cccDNA作为病毒转录模板，产物包括3.5 kb的PreC mRNA(pcRNA)和前基因组RNA(pgRNA)，2.4 kb和2.1 kb的S mRNA以及0.7 kb的X mRNA。

pgRNA是乙型肝炎病毒逆转录的模板。在衣壳内，聚合酶将pgRNA反转录为rcDNA，然后在内质网膜上由包膜蛋白包裹后，分泌病毒颗粒至细胞外，或重新进入细胞核补充cccDNA储存池。除rcDNA外，病毒反转录还可以产生双链线性DNA，这种DNA可以作为病毒DNA分泌，也可以进入细胞核形成cccDNA。有研究表明，双链线性DNA可以随机整合到宿主基因组中，致使染色体不稳定性增加、HBV基因和HCC相关宿主基因发生插入性突变，促进HCC的发生[3-4]。整合的HBV DNA虽然不能产生具有病毒复制能力的pgRNA，但是可以作为S mRNA的转录来源，增加HBsAg的表达水平[5]。

血清和配对肝组织中HBV RNA深度测序结果表明，病毒准种之间的复杂性和平均遗传距离非常相近[6]，提示血清中的HBV RNA可能来自受感染的肝细胞，但是HBV RNA进入循环的机制尚未完全清楚。为了确认外周检测到RNA的种类，Wang等[7-8]设计的RT-PCR分别检测总HBV RNA和3.5kb RNA，结果提示二者拷贝数近似，进一步设计3.5kb HBV RNA和pcRNA特异性引物后扩增，排除pcRNA后结果与此类似，证实外周检测到的HBV RNA主要来源于pgRNA，并进一步证实pgRNA主要以片段化或剪接体形式存在。同时也有研究结果显示[9-10]，感染HBV的离体细胞可以分泌大量无包膜蛋白的裸衣壳，其中包括有pgRNA在内所有类型的复制中间产物。pgRNA反转录为rcDNA，包被表面蛋白后以Dane颗粒的形式分泌到外周血中，但同时也有研究发现[11]，部分含pgRNA的衣壳能够在成熟前释放到外周血中，可能是宿主对抗HBV感染的防御机制之一。因此，需要更多的研究来描述HBV RNA病毒颗粒在慢性HBV感染中的生物学机制。

二、血清HBV RNA在NAs停药中作用研究

国际主流的HBV管理指南对于NAs停药的推荐建议包括[12-14]：无肝硬化HBeAg阴性患者治疗至少2～3年，达到持续的病毒抑制；对于HBeAg阳性者发生血清学转换、HBV DNA持续监测阴性且经至少12个月巩固治疗，停药后均需密切监测随访。但是，这些推荐建议并不一致并且远未满足临床实践需求。

HBV RNA是从cccDNA转录而来，所以理论上HBV-RNA的水平可能可直接反映cccDNA水平。既往的小队列研究结果表明[7,15-17]，外周循环HBV RNA与肝细胞中的cccDNA存在正相关，可被视为cccDNA的替代标志物，有可能用于预测治疗后的应答及指导NAs的安全停药。Masataka等在36例患者的队列研究中[18]，应用NAs平均治疗时间36周，停药24周后，52.8%(19/36)的患者出现病毒学反弹，多变量分析结果表明，治疗第3个月的HBV DNA+RNA滴度与病毒学反弹独立相关(OR：9.474，P=0.043)。国内Wang等在33例患者的队列研究中[7]，所有患者治疗结束时HBV DNA检测不出，停药后随访24周，HBV RNA阳性患者发生病毒学反弹比率显著高于HBV RNA阴性患者,且二者差异具有统计学意义(21/21, 100%比3/12, 25%;P=0.001)，推测HBV RNA水平可能与NAs停药后的病毒学反弹相关并且可能成为安全停药的生物学标志物。

Fan等[19]多中心、前瞻性队列研究发现，在评估队列中，HBeAg(+)患者在NAs治疗结束4年后，HBV DNA和HBV RNA(DNA-/RNA-)双阴性的患者临床复发(定义为HBV DNA>2 000 IU/mL并且ALT>2 ULN)风险，显著低于HBV DNA或HBV RNA单阳性的患者(分别为2/35, 8%和32/102, 31.4%,P=0.018)。在验证队列，随访5.5年，DNA-/RNA-双阴性的患者临床复发风险仍然低于HBV DNA或HBV RNA单阳性的患者(分别为2/13, 15.4%和9/27, 33.3%,P=0.286)，但差异无统计学意义。这些结果提示，HBV RNA阴性患者复发风险明显低于HBV RNA阳性患者人群。进一步多变量分析发现，HBV DNA和RNA水平是临床复发的独立预测因子，HBV DNA或HBV RNA任一阳性患者的临床复发风险为DNA-/RNA-双阴性患者的4.54倍(95%CI：1.09～19.00,P=0.038)。这些分析表明，非肝硬化HBeAg(+)患者HBV核酸双重阴性是指导NAs停药的有效生物标记物。作者同时比较了停药时HBV RNA、HBV DNA和HBsAg定量预测临床复发的ROC曲线下面积，发现HBV RNA分别高于HBV DNA和HBsAg定量(三者分别为0.732、0.630和0.543)，故作者建议未来研究使用HBV总核酸水平(总HBV DNA和RNA)作为指导HBeAg(+)患者NAs停药的生物标志物。

三、血清HBV RNA与其他NAs停药潜在标志物的相关性

目前认为有潜在价值的停药标志物包括cccDNA、HBV DNA、HBsAg、HBcrAg、anti-HBc等。理论上，初治患者血清中HBV DNA和RNA均可反映cccDNA转录活性，然而CHB患者在NAs治疗后，pgRNA反转录被抑制，HBV DNA水平下降，而RNA却长期持续存在，这使其成为比HBV DNA更有效、更直接反映cccDNA活性的标志物。Wang等的体外研究中，血清HBV RNA与cccDNA水平显著相关，而Allweiss等使用PegIFN降低cccDNA活性后发现，二者不具有显著的相关性，作者认为二者相关性可能受到HBeAg状态的影响[16,20]。国内张文宏等[6]的研究中，患者血清HBV RNA与cccDNA水平无显著相关，但与肝内HBV RNA/cccDNA比值显著相关，推测血清HBV RNA水平更多反映cccDNA的转录活性，而非数量上的相关。

血清HBV RNA与多个病毒学标志物均存在不同程度的相关性。多个研究表明，未经治疗患者血清HBV RNA与HBV DNA之间存在高度的线性正相关[21-23]。van Bommel等[24]同时证明，NAs治疗后血清HBV RNA与HBV DNA仍然相关，但相关性较前减弱。在未经治疗患者中，有研究显示HBeAg阴性患者血清HBV RNA和DNA的相关系数高于HBeAg阳性患者(r=0.741和r=0.532，P<0.001)[25]。但van Campenhout等[26]认为HBV RNA与DNA之间的相关性在HBeAg阳性和阴性患者中类似。这种差异可能是样本量、患者临床特征差异或采用的HBV RNA定量方法不同导致。

血清中HBV RNA与HBsAg定量之间的相关性，目前研究结果尚存在分歧。有研究表明，HBV RNA与HBsAg之间存在显著的线性正相关，但在HBeAg阴性患者亚组分析中，这种线性相关性未得到进一步确认[22]。而在新近的研究中，HBV RNA与HBsAg之间的线性相关性未能得到进一步的证实[27]，这种差异可能是由于样本量或是患者异质性导致。一项纳入11项研究、含1 716例患者来研究HBsAg定量在NAs停药中的作用，荟萃分析结果表明[28]，NAs中位治疗时间及巩固治疗时间分别为56.12个月和36.7个月，停药12月后，HBsAg定量<100 IU/mL和>100 IU/mL患者的病毒学反弹率分别为9.1%～19.6%和31.4%～63.6%，随访39个月后，HBsAg阴转比率分别为21.1%～58.8%和3.3%～7.4%。

新近有研究表明[29]，外周循环中HBcrAg水平可以作为指导NAs停药的新型生物标志物。究其原因，一方面HBcrAg检测包含核心抗原、HBeAg和22 kDa截断的前核心蛋白的总和，有研究认为其与cccDNA的相关性优于HBV RNA和HBsAg[30]，另一方面，有研究表明NAs治疗过程中，血清HBcrAg和HBV RNA水平显著正相关并且具有类似的下降特征[27]，同时在HBeAg阴性患者中，停止治疗时HBcrAg>3.7 log IU/mL患者，停药1年病毒学复发风险较低水平患者增加3.7倍(95%CI：1.187～11.856; P =0.024)[31]。Ivana等[1]研究19例NAs长期治疗达到HBsAg阴转后停药患者的随访显示，11%(2/19)患者停药后出现病毒学反弹，停药前及停药后2例患者均检测不出HBcrAg，但在停药时仍可检测到pgRNA，停药后pgRNA水平进一步升高，提示HBV RNA指导停药较HBcrAg可能更有优势，但样本量明显较少。抗-HBc定量在停药中的研究较少，Heng等研究显示[32]，100例患者NAs停药后随访1.0～3.5年，39例患者发生临床复发，高滴度抗-HBc患者的复发风险比是低滴度患者的0.31倍(95%CI：0.15～0.65,P=0.002)。总之，究竟哪一个标志物对停药后的应答预测更优、现有标志物如何联合使用及其价值有待于进一步研究确认。

NAs安全停药是CHB管理中的研究热点之一。虽然完全清除cccDNA的疗法可能会在不久的将来出现，但目前的临床实践中同样需要简单易行、安全的停药标准。目前的临床研究提出了包括HBV RNA在内等潜在可能用于临床实践的生物学标志物，然而，目前尚无统一标准的检测方法或可用的商品化检测试剂盒，其次，尽管决定HBV RNA水平的主要因素是cccDNA水平，但血清中HBV RNA水平仍然可能受HBV感染阶段、病毒基因型和pgRNA剪接变异体等因素的影响[10]。联合检测HBcrAg、HBsAg、抗-HBc和HBV RNA定量，并优化其组合方案来指导安全停药仍需要进一步研究。