液相色谱-串联质谱法测定山银花中有机酸和黄酮类化合物的含量

史颖珠，侯建波，谢文，钱艳，黄超群，张雅琴，刘翠平，张辉

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058）

（2.杭州海关技术中心，浙江杭州 310016）（3.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江杭州 310016）

山银花是从忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.，华南忍冬Lonicera confusaDC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C. Cheng 的干燥花蕾或带初开的花，并在夏初花开放前采收获得，自《中国药典》2005 年版起，与金银花进行区分。具有清热解毒，疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[1]。也具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗动脉粥样硬化等作用[2-5]。因此，2014 年正式被国家卫生计生委批准为“按照传统既是食品又是中药材物质”[6,7]。

图1 有机酸和黄酮类化合物结构式Fig.1 The chemical structures of investigated organic acids and flavonoids

研究发现山银花的有效成分除绿原酸，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙外，还有黄酮类化合物、挥发油类化合物、有机酸类和三萜类化合物[8-12]，研究人员通过HPLC，LC-MS/MS、高分辨质谱法和波谱学等方法来测定和鉴别山银花中各成分的结构和含量[13-15]，以及开展指纹图谱、产品和品种的鉴别研究[16-20]。目前已发表的分析方法中除高分辨质谱仪检测可一次性筛查出山银花中较多的有效成分外，其他检测均较难获得很多有效成分信息。但高分辨质谱仪价格昂贵，影响了它的应用范围。本文通过文献调研筛选出山银花中4 种主要有机酸和14 种黄酮类化合物，采用酸性甲醇溶液超声提取，HLB 固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，建立了如图1 所示的山银花中绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C、槲皮素、芦丁、木犀草素、木犀草苷、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆树苷、黄芩素、黄芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香叶木素、白杨素和山奈素含量测定的方法，实现了山银花中主要的4种有机酸和14种黄酮类化合物含量的同时测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器设备

API 4000 型三重四极杆串联质谱仪（配电喷雾离子源ESI，AB 公司，美国）；1100 型液相色谱仪（Agilent公司，美国）；Milli-Q Synergy 185 超纯水器（Millipore公司，美国）；IKA MS3 Basic 型涡旋器（IKA 公司，德国）；24 孔固相萃取装置（Supelco 公司，美国）；Heraeus Multifuge X1R 型台式离心机（Thermo 公司，美国）；P 300 H 型超声波清洗机（Elma 公司，德国）；G&G JJ500 型电子天平（双杰公司产品，中国）；Mettler AE260 型电子天平（Mettler Toledo 公司产品，瑞士）。

1.1.2 主要耗材和试剂

甲醇（色谱纯），Tedia 公司；甲酸（质谱级），Scharlau 公司；乙腈（色谱纯），Scharlau 公司；盐酸（优级醇），永华化学科技（江苏）有限公司；叔丁基对苯二酚（tert-Butylhydroquinone，简称：TBHQ，分析纯），Aladdin 公司；L-(+)-抗坏血酸（L(+)-Ascorbic acid，分析纯），广东光华科技股份有限公司；CNW C18固相萃取柱（6 mL，500 mg），Anpel 公司；Waters HLB 固相萃取柱（6 mL，200 mg），Waters 公司。

标准物质：绿原酸（纯度99.9%），ANPEL 公司；咖啡酸（纯度98.1%），ANPEL 公司；异绿原酸A（纯度98.8%），ANPEL 公司；异绿原酸C（纯度99.5%），ANPEL 公司；槲皮素（纯度96.4%），ChromaDex公司；芦丁（纯度95.0%），TRC 公司；木犀草素（纯度96.9%），ChromaDex 公司；木犀草苷（纯度98.9%），ANPEL 公司；山萘酚（纯度95.5%），中国食品药品检定研究院、紫云英苷（纯度99.1%），ANPEL 公司；芹菜素（纯度98.5%），Bepure 公司；野漆树苷（纯度98.9%），ANPEL 公司；黄芩素（纯度99.2%），ANPEL 公司；黄芩苷（纯度96.8%），ChromaDex公司；槲皮素-3-甲基醚（纯度97.0%），TRC 公司；香叶木素（纯度97.8%），ChromaDex 公司；白杨素（纯度98.0%），TRC 公司；山奈素（纯度97.8%），ChromaDex 公司。用甲醇将各化合物固体标准品溶解，稀释并定容获得10 mg/mL 标准储备液，根据需要用甲醇将其储备液稀释至所需浓度。

1.1.3 仪器工作条件

色谱参数：色谱柱：Mightysil RP-18，3 μm，4.6×150 mm，流动相：甲醇（A）-0.15%甲酸溶液（B），流动相梯度洗脱程序：0～10.0 min时40%（A）线性增加至75%；10.0～15.0 min时75%（A）线性增加至90%；15.0～22.0 min时90%（A）保持不变；22.0～23.0 min线性下降至40%（A）；23.0～30.0 min 40%（A）进行系统平衡；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL；柱温25 ℃。

质谱参数：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：负离子扫描；监测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：-4500 V；雾化气压力（GS1）：289 kPa（42 psi）；气帘气压力（GS2）：310 kPa（45 psi）；辅助气流速（CUR）：172 kPa（25 psi）；离子源温度（TEM）：540 ℃，驻留时间30 ms；其它质谱参数如表1所示。

表1 各化合物基本信息及质谱测定条件Table 1 Standard information and optimized mass spectrometric parameters of compounds

1.1.4 试验方法

称取0.5 g 试样（精确到0.01 g）置于50 mL 具塞离心管中，加0.5 g TBHQ，加入40 mL 50%的甲醇溶液，涡旋均匀，超声40 min（100 W，37 kHz，30 ℃），静置冷却至室温后，于8500 r/min 高速离心5 min，滤纸过滤上清液转移至50 mL 容量瓶中，加水定容至50 mL，混匀，取1 mL 加8.5 mL 水和0.5 mL 浓盐酸，涡旋混匀并转移至HLB 固相萃取柱中（依次用5 mL甲醇和5 mL 5%甲醇溶液活化），加入5 mL 5%甲醇溶液淋洗，抽干，加10 mL 甲醇进行洗脱，控制流速1～2 mL/min，收集全部洗脱液，定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm 有机滤膜，取1.0 mL 定容溶液，加40%的甲醇溶液稀释定容至25 mL，混合均匀，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2 数据处理

标准溶液和实验溶液通过液相色谱-串联质谱仪进行测试，以标准品峰面积Y 为纵坐标，以待测物质量浓度X（g/kg）为横坐标对标准溶液绘制标准工作曲线，并对实验溶液进行定量计算。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

本试验参考中国药典的方法[1]，采用超声方式进行提取，并考察了超声波清洗仪参数、抗氧化剂对提取情况的影响。结果发现，超声频率在37 kHz 和80 kHz，有效功率100 W，对提取结果显示无明显差别。比较超声时间在10、20、30、40、50、60 min 的提取情况，在40 min 时的回收率最高，当超声时间大于40 min 后，山银花本底中的绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A 和异绿原酸C 含量，和通过外部添加方式加入的黄芩素和黄芩苷回收率下降10%～15%。对比TBHQ和抗坏血酸两种不同抗氧化剂的保护情况，结果表明，在没有抗氧化剂的情况下，山萘酚的回收率低于70%，在TBHQ加入后，山萘酚的回收率可以达到80%以上，山奈素回收率提高约10%。综上情况，最终选择超声频率37 kHz，有效功率100 W，超声时间40 min，50%甲醇溶液，TBHQ 保护下开展提取实验。

2.2 净化条件的选择

本试验考察了C18和HLB 两种类型固相萃取柱的净化情况，以降低基质效应对液相色谱-串联质谱法定量测定的基质干扰，提高检测结果的准确性。取1 mL 200 ng/mL 的标准溶液（50%甲醇溶液，0.5 g TBHQ），加入9 mL 水，考察盐酸浓度分别为0%、2.5%、5%、10%、15%的净化情况，混匀上样后，采取5 mL 的10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液进行淋洗和10 mL 甲醇进行洗脱。结果如图2 所示，酸性环境有助于提高固相萃取净化时化合物的稳定性，不加盐酸时芦丁、木犀草素、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆树苷、黄芩素、槲皮素-3-甲基醚和香叶木素的净化回收率均低于含有盐酸的情况，对不同浓度的盐酸考察发现，盐酸浓度5%时化合物回收率整体较好。淋洗实验发现，在甲醇含量为20%时，在C18固相萃取柱中绿原酸和咖啡酸会被洗脱，在HLB 固相萃取柱中，甲醇含量大于30%时绿原酸和咖啡酸会被洗脱，HLB固相萃取柱的净化回收率和稳定性好于C18固相萃取柱。因此试验采用HLB 固相萃取柱，甲醇溶液上样（含有5%盐酸），5%甲醇淋洗，甲醇洗脱的方式进行净化。

图2 不同盐酸浓度在HLB 固相萃取柱中的净化情况对比图Fig.2 The results of different HCl concentrations in HLB solid phase extraction columns

2.3 色谱条件的考察

实验对比Mightysil RP-18，3 μm，4.6×150 mm 或Inertsil ODS-3，3 μm，4.6×150 mm 色谱柱，甲醇或乙腈为有机相，0.15%甲酸溶液或水为水相对目标化合物进行分离情况。结果表明，相同色谱条件下，绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C 在Mightysil RP-18 的分离效果好于Inertsil ODS-3，黄芩苷在Mightysil RP-18 为分离柱时谱峰峰形更好，信号提升约4 倍。因此采用Mightysil RP-18 为分离柱对目标化合物进行分析。在相同色谱柱和流动相梯度洗脱程序下，甲醇为有机相时大部分化合物的信号响应和峰形好于乙腈有机相（其中野漆树苷、芦丁、木犀草苷在甲醇为流动相时信号响应提升3～5 倍），综合考虑前处理采用甲醇进行洗脱净化，因此采用甲醇为有机相对目标化合物进行分离。对比相同色谱柱下甲醇为有机相，水和0.15%甲酸溶液为水相的分离情况，以Mightysil RP-18 色谱柱为例，在0.15%甲酸溶液中信号的峰形和响应好于水（其中绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C 和黄芩素在含0.15%甲酸时信号提升5 倍以上）。综上情况，实验以Mightysil RP-18为分离柱，甲醇和0.15%甲酸溶液为流动相，分析结果如图3 所示，该条件下相近离子对的化合物如异绿原酸A 和异绿原酸C，山奈素和香叶木素可以实现很好的分离。

2.4 质谱条件的考察

实验采用流动注射的方式在负离子模式下进行母离子全扫描获得准分子离子峰，再以准分子离子峰为母离子，对其子离子进行全扫描。按照欧盟EC/657指令和《质谱分析方法通则》的要求，选择两个特征子离子对目标化合物定量确证，以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。多反应监测负离子模式下优化的各质谱参数和最佳质谱条件参见表1。

图3 液相色谱-质谱/质谱法分离结果（2 ng/mL）Fig.3 The separation result of LC-MS/MS

2.5 基质效应的考察

试验通过计算离子抑制率的方式来考察基质效应情况[21]。[离子抑制率/%=（溶剂工作液中响应强度-基质加标溶液响应强度）×100%/溶剂工作液中响应强度]。测试相同浓度（40 ng/mL）的溶剂工作液和基质加标溶液中各化合物的信号响应强度，如表2 所示，各化合物离子抑制率均小于15%，即试验条件下获得的基质溶液无明显的基质效应，因此采用甲醇-0.15%甲酸溶液（体积比4:6）稀释获得线性工作曲线溶液进行定量计算。

2.6 方法的线性关系，定量限和回收率实验

在确定实验条件下进行检测，方法定量限（以S/N＞10 计）0.005 g/kg（槲皮素、芦丁、木犀草苷、紫云英苷、芹菜素、黄芩苷和槲皮素-3-甲基醚），0.025 g/kg（木犀草素、野漆树苷、香叶木素和山奈素）和0.05 g/kg（绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C、山奈酚、黄芩素和白杨素）。对浓度0.05、0.10、0.20、0.50 和1.00 g/kg 的线性工作曲线溶液进行测试，以标准品峰面积Y 为纵坐标，以待测物质量浓度X（g/kg）为横坐标绘制标准工作曲线如表3 所示，线性方程的相关系数r2大于0.993。

表2 山银花基质对各化合物的基质效应情况Table 2 The matrix effect of Lonicerae flos on the investigated compounds (n=3)

表3 待测化合物的线性方程及相关系数Table 3 The linear equation and correlation coefficients (r2) of compounds

表4 山银花中3 个水平下的加标回收率和相对标准偏差Table 4 The results of recoveries and correlation coefficients (n=6)

注：回收率=（测定结果-空白值）/添加浓度×100%。

表5 山银花中有机酸和黄铜类化合物含量测定结果Table 5 The contents of organic acid and flavonoids in Lonicerae flos

对山银花样品（样品含绿原酸21.0 g/kg，咖啡酸1.50 g/kg，异绿原酸A 11.2 g/kg，异绿原酸C 10.3 g/kg），进行3 个浓度水平的添加回收实验（添加水平绿原酸10.0、20.0 和40.0 g/kg，咖啡酸1.0、2.0 和4.0 g/kg，异绿原酸A 和异绿原酸C 5.0、10.0 和20.0 g/kg，其他化合物0.05、0.10 和0.20 g/kg），每个浓度水平取6 个平行样。测定绿原酸，咖啡酸，异绿原酸A 和异绿原酸C 时，将测试溶液进行稀释至溶液浓度在线性范围内。结果如表4 所示，采用外标法定量，方法总体回收率69.2%～116%，相对标准偏差：3.3%～12.0%。

2.7 实际样品测试

应用实验方法对11 个山银花进行检测，结果如表5 所示，山银花中绿原酸、异绿原酸A 和异绿原酸C的含量最高，其次是木犀草苷和紫云英苷。样品中有8 个化合物（山奈酚、野漆树苷、黄芩素、黄芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香叶木素、白杨素和山奈素）含量低于方法定量限。

3 结论

本试验通过甲醇溶液超声提取，酸性溶液上样，HLB 固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法检测，外标法定量，实现了对山银花中18 种主要有机酸和黄酮类化合物（绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸C、槲皮素、芦丁、木犀草素、木犀草苷、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆树苷、黄芩素、黄芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香叶木素、白杨素和山奈素）含量的测定。对11 个山银花样品的测定结果显示绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草苷和紫云英苷是其主要成分。研究结果对后续分析各化合物含量与药物活性关系，山银花品质和品种研究具有重要的辅助作用。