全球基因I 型非洲猪瘟病毒流行与疫苗研究进展

戈胜强，屈海龙，路皓东，韩乃君，胡永新，左媛媛，张潇月，吴晓东，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东农业大学，山东泰安 271001）

非洲猪瘟病毒于1921 年在肯尼亚（非洲东部）首次报道，但该文章提到早在1909 年时就发现有类似疫病流行，且主要在肯尼亚的欧洲殖民者引入的家猪群体中暴发[1-2]。所以非洲猪瘟最早还被称为“东部非洲猪瘟（east African swine fever）”。考虑到非洲野猪（疣猪、丛林猪等）感染后不发病且非洲存在森林循环（野猪与软蜱相互感染传播），所以推断非洲猪瘟病毒可能早已在非洲大陆出现[3]。后期追溯调查显示，1921 年，在赞比亚东部省份（非洲中南部）也发现有类似疫病发生[4]。随后，非洲Maasstroom 地区（南非东北部，1928年）[5]，安哥拉共和国（非洲西南部，1932 年）和马拉维共和国（非洲东南部，1931 年）均报道发现该病。至1950 年，非洲东部、南部和中非南部均已发现该病。但直至20 世纪50 年代后期传入西非以及欧洲葡萄牙（1957 年）、西班牙（1960 年）等国家后非洲猪瘟才开始被全世界关注和研究[6]。1957 年后在欧洲、南美洲和加勒比地区流行的毒株均为基因I 型毒株（基于P72基因C 末端序列分型），因此基因I 型毒株也曾被称为ESAC-WA基因型，即欧洲、南美洲、加勒比海地区和西非流行 株（Europe，South America，the Caribbean and West Africa，ESAC-WA）[7]。伴随着葡萄牙、西班牙经过30 多年的根除净化成功，2000 年之前除意大利撒丁岛（基因I 型）和非洲存在非洲猪瘟（24个基因型皆有）外，其他国家均全部消灭非洲猪瘟。但2007 年基因II 型非洲猪瘟传入格鲁吉亚后，全世界再次陷入基因II 型的流行扩散中，欧亚大陆北部（俄罗斯，2007 年）、东欧（乌克兰，2012 年）、中欧（波兰，2014 年）、西欧（比利时，2018 年）、东亚（中国，2018 年）、东南亚（越南，2019 年）、南亚（印度，2020 年）、大洋洲（巴布亚新几内亚，2020 年）和加勒比地区（多米尼加，2021 年）均相继暴发非洲猪瘟。2021 年中国报道在临床样本中发现基因I 型非洲猪瘟病毒，与当前流行的基因II 型强毒株差异显著。基因I 型毒株在亚洲区域属于首次发现，国内目前尚无专业介绍，没有全面展示基因I 型非洲猪瘟病毒的流行与研究现状，为此作者就此方向进行综述，以期为我国非洲猪瘟的科学防控提供参考。

1 全球流行概述

自非洲猪瘟首次被报道以来（1921 年），早期发现的毒株因技术/年代久远等原因未进行基因分型。目前可追溯的最早明确的基因I 型毒株可能是1957 年首次传入葡萄牙的里斯本57 毒株（Lisbon 57，Genbank-AF301537），后经序列比对，认为该毒株最可能来源于刚果民主共和国[3]。随后，第二次传入葡萄牙并在欧洲蔓延的里斯本60 毒株（Lisbon 60，AF301539）、1962年西班牙毒株（Madrid/62，AF449461）、1964 年法国毒株（Fr64，FJ174374）、1968 年葡萄牙自然弱毒株（NH/P68，DQ028313）、1985 年比利时毒株（BEL/85，AF449466），1988 年葡萄牙软蜱分离弱毒株（OUR T88/3，AM712240），以及在南美洲发现的1979 年巴西毒株（Brazil/79，AF302809）和在加勒比海地区发现的1979 年多米尼加共和国毒株（DomRep/79，AF301810）等也均属于基因I 型[7]。上述国家/地区（除非洲和意大利撒丁岛），通过多种根除策略，均成功根除该病。即截至2000 年，基因I 型毒株理论上只存在于意大利撒丁岛、非洲地区和欧洲部分实验室（用于致病性和疫苗研究）。

非洲猪瘟病毒的24 个基因型在非洲均有分布，其中基因I 型主要分布在西非。据报道[8]，1959 年塞内加尔共和国（西非西部）有非洲猪瘟疫情确诊。1973 年，尼日利亚联邦共和国（西非东南部）发现过非洲猪瘟疑似病例（未官方确认），但直到1997 年官方才正式确认本地存在非洲猪瘟[9]。1982 年，喀麦隆共和国（非洲中西部）报道有基因I 型毒株流行[10]。但西非的基因I 型毒株流行蔓延主要开始于1996 年，由科特迪瓦共和国开始逐步扩散传播至贝宁共和国、佛得角共和国（1996—1999 年）、多哥共和国、尼日利亚联邦共和国（1997年）、塞内加尔共和国（1996—1999 年、2001 年和2002 年）、加纳共和国（1999 年）、冈比亚共和国（1997 年和2000 年）、布基纳法索（2003 年），直至传入马里共和国（2016 年）[7，11-13]。此外，基因I型毒株在刚果民主共和国（非洲中部，1967年）、安哥拉共和国（非洲西南部，1972 年）、姆库兹（南非，1979 年）、纳米比亚共和国（非洲西南部，1980 年）、赞比亚（非洲中南部，1983 年）[14]和津巴布韦共和国（非洲东南部，1990 年）等国家也有被分离的报道[7，15]。进一步分析显示，同属于基因I 型的毒株可以进一步被P54基因分为a、b、c、d 四个分支。占比最大的Ia 分支毒株主要来源于欧洲和南美洲地区，Ib分支毒株主要来自西非国家（还包括最早传入欧洲的Lisbon 57）。而1960 年传入葡萄牙的Lisbon 60 被划为Ic 分支，1979 年南非毒株（MZUKI/1979）被划为Id 分支[15]。结合血清群分型差异（Lisbon 57 毒株和Lisbon 60 毒株分别属于血清1 群和血清4 群）[16]，可以推断分别于1957 年和1960 年传入葡萄牙的基因I 型毒株可能为不同来源毒株。

2 弱毒活疫苗研发进程

基因I 型非洲猪瘟传入欧洲后，给当地养殖业造成巨大影响。如1960 年4 月非洲猪瘟传入葡萄牙后，截止到12 月已扩散至16 个省份的187 个地点，造成14 629 头猪死亡或被扑杀，并于同年传入西班牙[17]。为快速、有效控制该病，葡萄牙和西班牙均启动了弱毒活疫苗（细胞传代致弱株）的临床试验。葡萄牙临床试验规模达55 万多头，而西班牙试验规模较小（交流所得）。但因种种原因，特别是弱毒活疫苗使用后的并发症问题超过了试验预期，最终导致试验终止。大规模临床试验不可避免导致毒株外溢，并被学术界认为与伊比利亚半岛随后30～40 年间的低毒力毒株流行相关联[18]。特别是1968 年葡萄牙从一慢性感染猪体内发现的无红细胞吸附活性的自然弱毒株NH/P68 毒株（也称NHV），经推测可能就是葡萄牙临床使用的弱毒疫苗候选株演变而来[19]。1988 年，葡萄牙又从栖居于猪场的游走钝缘蜱（O.erraticus）中分离到无红细胞吸附活性的弱毒株，命名为OUR T88/3、OUR T88/4 和OUR T88/5 等[20]。自然弱毒株NH/P68 和OUR T88/3 的发现为基因I 型非洲猪瘟病毒疫苗研制提供了新方向。

2.1 自然弱毒株

2001 年，Leitão 等[21]将31 头25～45 kg 的 长白杂交猪以5×106CPE50/头的剂量接种NH/P68，结果肌肉注射和口鼻接种的猪中分别有47%（9/19）和25%（3/12）出现慢性病程（主要症状包括体温升高、皮肤坏死斑和关节肿大）。随后对无症状的猪以5×106CPE50/头的剂量肌肉注射接种基因I 型强毒株Lisbon 60，结果所有猪均能抵御强毒株攻击，但79%（15/19）的猪有一过性体温升高（2～5 d）。另有试验[22]证实，4 头杂交猪以105TCID50/头的剂量肌肉注射接种NH/P68 后，于第72 天再放入2 头未接种哨兵猪，结果4 头接种猪出现不同程度的慢性病程（症状包括体温升高、关节肿大、体重减轻和伴随阵发性咳嗽的呼吸困难），而2 头哨兵猪中1 头出现慢性病程（症状包括体温升高、关节肿胀和呼吸系统问题），1 头除有轻微体温升高外未有明显临床反应，但2 头猪均抗体转阳。相似的，OUR T88/3 的接种试验[23]发现：以103～105TCID50/头的剂量鼻内或肌肉注射接种OUR T88/3 后（每组6 头）于第21 天再肌肉注射强毒株OUR T88/1（104TCID50/头），结果103～105TCID50的鼻内接种组攻毒后保护率分别为100%、100%和66%（4/6），103～104TCID50的肌肉注射接种组攻毒后保护率分别为50%（3/6）和67%（4/6），且各组存活猪中部分出现体温升高、关节肿胀、皮肤坏死斑、结膜炎等慢性非洲猪瘟病症。此外，105TCID50肌肉注射组中有3 头猪因出现非特异性体温升高而终止试验（经排查可能之前有细菌感染）。以上试验说明，自然弱毒株NH/P68 和OUR T88/3 仍具有一定毒力，并不太适合作为疫苗种毒。

2.2 基因缺失株

虽然基因I 型自然弱毒株无法满足疫苗使用条件，但基于此毒株的疫苗研究方向并没有停止。利用基因敲除重组技术，研究者以NH/P68 或OUR T88/3 为骨架，继续敲除毒力基因或免疫调控基因，分别获得NH/P68ΔA238L、NH/P68ΔA224L、NH/P68ΔEP153R[24]和OUR T88/3ΔDP2[25]等多种基因缺失株。结果显示以NH/P68 为骨架的基因缺失株接种（106TCID50/头，肌肉注射）后出现临床副反应的比例分别是100%（ΔA238L）和75%（ΔA224L和ΔEP153R），但攻毒（Lisbon 60，105TCID50/头）后能提供完全保护。以OUR T88/3 为骨架的缺失株接种（104TCID50/头，肌肉注射）后有50%（3/6）的猪出现临床副反应（体温升高和关节肿胀），攻毒（OUR T88/1，104HAD/头）后保护率为67%（4/6）。同时，基于基因I 型强毒株的基因缺失改造工作也在不断尝试。2017 年，Monteagudo等[26]以BA71 强毒株（1971 年分离自西班牙巴达霍斯省一发病猪脾脏）为骨架敲除CD2v基因（BA71ΔCD2），结果发现：BA71ΔCD2接种家猪（103PFU/头，肌肉注射）后无任何临床症状，攻毒（BA71，103HAU/头）后保护率为33%（2/6），但大剂量（3.3×104PFU/头或106PFU/头）免疫BA71ΔCD2后能提供完全攻毒保护。为进一步解决BA71ΔCD2免疫后个别猪只中存在低载量病毒血症问题，研究者在BA71ΔCD2基础之上继续删除了DP96R基因（BA71ΔCD2DP96R）和EP153R基因（BA71ΔCD2EP153R），结果发现BA71ΔCD2DP96R和BA71ΔCD2EP153R接种（106PFU/头，肌肉注射）后仍存在低载量病毒血症，而且攻毒后（Georgia 2007/1，103HAU/头）保护率分别降为83%（5/6）和67%（4/6）。这说明敲除DP96R和EP153R基因后并没有增加BA71ΔCD2的安全性，反而使其攻毒保护能力降低[27]。此外，研究者还以Benin 97/1 强毒株（1971 年分离自西非贝宁共和国发病猪场）为骨架敲除了MGF基因（BeninΔMGF）。结果显示：BeninΔMGF接种2 次（肌肉注射，首免102TCID50/头，25 d 后第二次免疫，104TCID50/头）后出现一过性体温升高，无任何临床症状。一次免疫后第46 天，使用强毒株Benin 97/1 进行攻毒（104TCID50/头，肌肉注射），体温、临床表现均正常[28]。相似的，以Benin 97/1 强毒株为骨架敲除了DP148R基因（BeninΔDP148R），接种2 次（肌肉注射，首免103HAD50/头，21 d 后重复加免1 次）后出现一过性体温升高（持续1～2 d），无任何临床症状。一次免疫后第42 天，使用强毒株Benin 97/1 进行攻毒（104HAD50/头，肌肉注射），结果2 头猪出现体温升高，其余3 头猪体温、临床表现正常[29]。分析以上所有基因缺失毒株结果，可以推断基因敲除策略可以提高毒株的安全性和保护效果，但具体基因的使用搭配等需要进行大量试验验证，目前还未有理想的基因I 型基因缺失疫苗候选株进一步进行临床试验。

2.3 细胞传代致弱株

葡萄牙弱毒活疫苗（以1960 年分离的Lisbon 60 毒株或1961 年分离的1455 毒株为母本毒株，在猪骨髓细胞上连续传代所得）[17]临床试验终止后，虽然再没有进行过大规模的相关试验，但可以明确的是，非洲猪瘟病毒经过细胞连续传代可以导致毒力减弱。以此为理论依据，研究者对非洲猪瘟强毒株进行了多种细胞系的传代适应改造，研制了多种细胞传代致弱株并进行了动物试验评价[30]。但因基因分型技术早期还无法应用，所以细胞传代致弱株的研究一开始并没有特别关注基因I 型，而是对现有分离株进行了多种尝试。如Hinde 毒株（分离自肯尼亚，可能为基因X 型）和Tengani 毒株（分离自马拉维，可能为基因V 型）[7]分别在猪肾细胞（1968 年）[31]和幼仓鼠肾细胞（1974 年）[32]中连续传代致弱。基因I 型的传代致弱株研究主要是以西班牙或葡萄牙本地分离株为主，如经典毒株BA71v（将1971 年西班牙分离株BA71 在Vero 传代致弱）[33]和E75CV1（将1975 年西班牙分离株在猴肾成纤维细胞传代致弱）[34]。进一步研究[35]显示，家猪接种E75CV1（104HAU50/头，肌肉注射）能全部存活且能抵御同源强毒株（E75，104HAU50/头）的攻击，但105HAU50/头和102HAU50/头接种组的存活率均为50%（2/4）。近期文章[36]显示，俄罗斯联邦病毒学和微生物学研究中心（原全俄兽医病毒学与微生物学研究所）对细胞传代致弱株也进行了大量研究，特别是对基因I 型细胞传代弱毒株FK-32/13（将法国1964 年分离株France-32，在猪骨髓细胞传代135 代致弱）进行了深入研究。试验数据显示：家猪接种FK-32/135（107.3HAU50/头口服接种，或106.7HAU50/头肌肉注射）后临床反应程度在正常范围内且能抵御同血清群强毒株的攻击（保护率为80%～100%）；进一步浓缩，使用25 倍浓缩剂量（108.3HAU50/头，肌肉注射）接种后可在7 d 时产生80%～100%的攻毒保护效果，免疫保护期达4 个月且不干扰其他病毒疫苗效果；使用100 倍浓缩剂量（109.2HAU50/头，肌肉注射）接种后最快可在第3 天对强毒株（France-32，104.0HAU50/头）产生100%的免疫保护。分析以上所有细胞传代致弱株结果，可以推断细胞连续传代可以达到致弱非洲猪瘟病毒的目的。但要对其进行科学评价特别是合适传代次数的筛选，需要开展大量试验验证，工作量巨大且具有一定的盲目性和随机性。

3 流行演变推测及防控策略

根据国外基因I 型自然弱毒株（NH/P68 和OUR T88/3）研究数据和国内基因I 型分离株（HeN/ZZ-P1/21 和SD/DY-I/21）试验数据[37]，可以判断国内分离的基因I 型毒株仍具有一定毒力，仍会导致一定的临床表现，特别是关节肿胀、皮肤坏死等非洲猪瘟慢性病程典型症状，而且具有一定的水平传播能力。基因I 型毒株与基因II 型毒株（强毒株、变异株）共同在国内存在，提示当前防控形势更加复杂，特别是冬季来临后，低温环境对消毒剂会产生一定的影响且正好满足非洲猪瘟病毒低温环境抵抗力强的特点。因此，假如阳性病例出现后净化不彻底，病毒可能会进一步污染屠宰场、市场，乃至人员日常接触频繁的纸币、日常用品等，并导致环境病毒载量居高不下，给猪场造成巨大的传入风险。在此情况下，深入了解环境病毒污染面，及时进行消毒灭源工作极其重要。

基因I 型病毒与基因II 型病毒基因组序列存在一定差异，特别是CD2v和MGF（多基因家族）部分区域差异较大。现有的常用荧光定量诊断方法（以P72基因为靶基因）或三重荧光定量方法（以P72、CD2v和MGF基因为靶基因）需要进行更深入的评价，确定其对基因I 型毒株的敏感性或特异性是否发生变化。此外，对于毒力较弱的基因I 型毒株或基因II 型变异株，血清学诊断方法具有一定的差异优势，因此也需加快其产业化报批进程并适时推广应用。同时，非洲猪瘟病毒已在我国定殖并形成较大污染面，进行疫病间交叉感染影响及多种疫病的多重诊断方法研究也具有一定实际意义。非洲猪瘟在长时间流行传播过程中存在毒力减弱趋势，结合临床中已经发现的基因I 型毒株和基因II 型变异株，未来临床中出现症状温和，乃至无任何临床症状的非洲猪瘟病例可能增加，这会导致出现“耐过猪”/“存活猪”现象并难以早期发现，值得警惕和重视。