酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子

韩晓蕾，高仕祺，张 帆，羊 健，刘 芃，姜鸿明，李林志，*

(1.烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265500； 2.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 265500； 3.宁波大学/农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 宁波 315000)

小麦黄花叶病是严重威胁我国小麦生产的主要土传病害之一，主要是由小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus，WYMV)引起，并以禾谷多粘菌(Ploymyxagraminis)为介体进行传播。根据调查，小麦黄花叶病在我国分布广泛，已遍及长江流域各省份以及河南、陕西等省。据统计，该病害可导致小麦减产20%～30%，严重的时候达70%～80%，并呈逐年蔓延趋势。1927年，首先在日本鉴定得到WYMV基因组序列。随后，我国河南、江苏、四川等地区的WYMV分离物基因组序列也被相继报道[1]。WYMV病毒粒子呈弯曲线状且基因组由两条单链正义RNA组成[2]。RNA1包含了7 635个核苷酸，共编码8个蛋白，分别命名为：P3、7K、CI(细胞质内含体蛋白，cytoplasmic inclusion)、14K、VPg、NIa(细胞核内含体蛋白a，nuclear inclusion a)、NIb(细胞核内含体蛋白，nuclear inclusion b)和CP(外壳蛋白，coat protein)[3-5]。其中，P3可以通过+2移码产生P3 N端部分蛋白P3N-PIPO(N-terminal portion of P3 protein)[6]。RNA2共编码核苷酸3 651个，编码约100 ku的多聚蛋白，被切割后生成两个成熟的非结构蛋白P1蛋白与P2蛋白[7-9]。研究表明，WYMV中的7K和14K蛋白具有一个跨膜结构域，推测与病毒复制、胞间运动相关[10]；HC-Pro为马铃薯Y病毒属成员，研究发现与P1的蛋白结构十分相像，可能与RNA沉默抑制的活性有关[11]；VPg具备NLS(核定位信号，nuclear localization signal)和NES(核穿梭信号，nuclear export signal)，推测VPg具有病毒长距离移动及复制功能[12]。

病毒不但基因组简单，被编码的蛋白少。而且病毒的复制、病毒粒子组装和侵染等都需要借助于寄主的代谢系统完成[13]。目前，筛选蛋白间互作的方法众多，其中酵母双杂交技术已被普遍应用于各类生物的蛋白质互作试验中。因此，利用该技术筛选病毒蛋白的互作靶标对研究病毒的致病机制至关重要[14-15]。Zhao等[16]以番茄花叶病毒(tomato mosaic tobamovirus，ToMV)运动蛋白(movement protein，MP)为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选本氏烟cDNA文库，分离得到寄主互作因子核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(Rubisco small subunit，RbCS)。该基因沉默后，病毒在系统叶中的侵染受到限制，表明RbCS参与了病毒运动过程。Kong等[17]利用酵母双杂交系统，以水稻条纹病毒(rice stripe virus，RSV)病害特异性蛋白(disease-specific protein，SP)为诱饵，筛选水稻cDNA文库，得到一个放氧复合体蛋白(oxygen-evolving complex，OEC)。进一步研究表明，SP通过改变OEC的亚细胞定位和叶绿体的结构功能，从而增强了病毒症状的形成。前期报道表明，P2蛋白具有重排细胞内质网并形成聚集结构的能力，同时能够与P1、P3、Nia-Pro及VPg互作，并将其招募至聚集结构中，与WYMV的复制密切相关[18]。目前，关于WYMV-P2在病毒与寄主分子相互作用中起到哪些具体功能和机制仍知之甚少。且对于WYMV编码的蛋白与寄主因子互作机制研究相对较少。我们主要运用酵母双杂交技术筛选出与P2互作的候选寄主因子，为研究WYMV致病机理奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为小麦品种扬麦158，cDNA保存于-80 ℃冰箱备用。大肠埃希菌(Escherichiacoli)感受态Mac1-T1 Competent Cell、DH5α农杆菌感受态。DH10B、Y187购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦cDNA构建

文库是利用Clontech Mate&Plate TM Library Construction方法进行构建。并运用Trizol方法[19]，提取总的小麦RNA并融解在RNase-free H2O中，用超微量分光光度计仪器测量RNA的纯度与浓度。分离纯化后，根据Fast Track MAG mRNA Isolation Kit说明书中的方法获得mRNA。然后，反转录成cDNA。初级文库的构建是通过Clone-Miner方法进行。把提取到的初级文库质粒稀释成300 ng·μL-1后，在酵母载体pGADT7-DEST进行LR重组反应试验，电转化于DH10B感受态细胞后，成功获得可以用于酵母双杂交的小麦cDNA文库。把提取的质粒转至Y187感受态细胞中，获得小麦cDNA酵母文库。用1.5 mL离心管分装备用。

1.2.2 文库质量的测定

取10 μL酵母文库大肠埃希菌甘油菌，利用无菌水以100倍比例稀释，用104、106和108的菌液100 μL涂布在LB琼脂平板上(Amp+)，并计算菌落生成个数。根据公式计算文库滴度：文库滴度=平板的克隆数×稀释的倍数×103/涂板体积。将cDNA文库质粒用大肠埃希菌感受态Mac1-T1中转化后，取100 μL均匀涂布在LB琼脂平板上(Amp+)，从中随机挑选单克隆，利用pGADT7通用载体引物对其进行PCR检测，检测插入片段大小。利用公式：文库重组率=(反应个数/反应总数)×100%，计算重组率。

1.2.3 Y2HGold酵母感受态细胞的制备

运用Clontech Matchmaker TM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual 说明书方法进行。从-80 ℃冰冻保存的Y2HGold酵母细胞在YPDA琼脂平板上进行划线，放置30 ℃培养箱3 d后，在YPDA琼脂平板上挑取新鲜的单克隆菌落至3 mL的YPDA液体培养基中，于30℃摇床以250 r·min-1振荡8～12 h。吸取5 μL至50 mLYPDA液体培养基中，30 ℃以250 r·min-1摇至D值为0.4～0.6；5 000 r·min-1离心收集菌体，用ddH2O洗涤酵母细胞后，以1.5 mL的1.1×TE/LiAc重悬菌液，最终形成酵母感受态并用于后续试验。

1.2.4 重组诱饵载体pGBKT7-P2的构建

以侵染小麦黄花叶病毒的小麦cDNA为扩增模板扩出目的片段；扩增产物及pGBKT7-T载体用BamHⅠ和SmaⅠ在37 ℃条件下酶切4 h后，用T4连接酶4 ℃连接过夜，连接产物转化至Mac1-T1大肠埃希菌感受态细胞中。此后用pGBKT7通用引物对单克隆进行检测，并用含有卡那霉素的LB培养基对阳性单克隆进行扩培，质粒提取后送杭州有康生物公司进行测序。将重组的质粒pGBKT7-P2、空载体pGADT7，转入到Y2HGold酵母感受态细胞中，涂布在两种营养缺陷培养基上。倒置在30 ℃培养箱，孵育2～3 d后观察菌落生长情况，并判断诱饵质粒pGBKT7-P2是否有自激活能力和毒性。

1.2.5 小麦cDNA文库筛选

将15 μg的cDNA文库质粒和2 μg诱饵重组质粒pGBKT7-P2共同转至酵母感受态细胞中，均匀涂布在两种筛选培养基SD(-Trp/-Leu)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)平板上，30 ℃孵育，筛选阳性克隆。提取生长正常的单克隆质粒，转化至DH5α感受态中，测序。测序结果在NCBI上进行Blast比对后，获得候选靶标的基因全长。将其中两个基因Ta14-3-3与TaTIFY的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)构建至pGADT7中(引物见表1)，获得靶标载体pGADT7-Ta14-3-3及pGADT7-TaTIFY。将靶标载体分别与pGBKT7-P2共转至酵母感受态细胞中，并在缺陷型培养基SD(-Leu/-Trp)和SD(-Leu/-Trp/-His/-Ade)中进行培养，验证互作结果。

表1 酵母重组质粒构建引物

2 结果与分析

2.1 小麦cDNA文库的构建及检测

小麦文库构建完成后，通过文库滴度计算公式，得到小麦cDNA文库滴度大于1.0×108CFU·mL-1，库容量算得为3.2×107CFU，重组率大于96%。文库质粒经转化后，随机挑选平板上生长状态良好的47个单克隆进行PCR扩增检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测。图1显示，插入片段大小范围主要分布在300～1 000 bp，密集分布于700～800 bp，且没有发现空载体。由此说明，本实验构建的cDNA文库完整性及覆盖度较好，达到了标准cDNA文库的要求，可用于后续的试验。

2.2 诱饵载体的构建

用T4连接酶连接，成功获得诱饵载体pGBKT7-P2。经测序结果显示，重组载体读码框正确，无移码突变(图2)。将载体pGBKT7-P2与pGADT7转入酵母Y2HGold细胞感受态中，涂布在两种筛选培养基SD(-Trp/-Leu)和 SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)中，30 ℃培养2～3 d观察发现，转化菌落都能在筛选培养基SD(-Trp/-Leu)板上正常生长，且与对照相比，生长速度无明显差别。但在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)上均不能生长(图3)。确定诱饵质粒对酵母菌株没有自激活能力和毒性，可以用与下一步筛选试验。

2.3 筛选与WYMV-P2互作寄主因子

将诱饵载体pGBKT7-P2与本实验构建的文库质粒共转至酵母感受态中后，从SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固体筛选培养基上筛选与WYMV-P2互作的候选蛋白。经PCR检测后，共得到52个阳性克隆。经NCBI在线工具预测后，发现得到的阳性克隆包含了18个蛋白，其功能如表2所示。为了说明P2寄主靶标的功能与植物抗逆性密切相关的候选靶标蛋白进行了序列分析。序列分析表明，TaTOM75全长为1 146 bp，共编码氨基酸382个，有一个Major intrinsic protein(MIP)结构域；TaRS31全长2 742 bp，编码914个氨基酸，包含两个RNA recognition motif(RRM)结构域，分别位于第1到32位，及第55位到123位氨基酸；TaLIP为1 275 bp，编码425个氨基酸，Pfam预测第95到312位为PAP fibrillin结构域；Ta14-3-3的ORF长度为789 bp，其蛋白序列包含一个典型的14-3-3蛋白结构域；TaTIFY-10A编码全长序列为1 012 bp，其蛋白序列第86位到第119位氨基酸为TIFY家族结构域，且在第152到177位是Divergent CCT基序(CCT2)；TaUBPA2c为1 701 bp，编码567个氨基酸，包含一个典型的RNA recognition motif(MMR)结构域。TaBOI的ORF区为1 021 bp，编码340个氨基酸。TaBAG6全长为2 775 bp，编码925个氨基酸，这两个蛋白均为E3泛素化相关蛋白。为了进一步验证酵母双杂交的准确性，我们随机选择了两个蛋白TaTIFY与Ta14-3-3，并将其ORF区在小麦cDNA中克隆并构建在pGADT7形成靶标载体pGADT7-TaTIFY及pGADT7-Ta14-3-3。随后分别将pGADT7-TaTIFY、pGADT7-Ta14-3-3与诱饵载体P2-pGBKT7共转至酵母感受态中。

M，DL8000 对照；1～47，重组子。M， DL8000 DNA marker; 1-47， Recombinants.图1 四十七个单克隆的PCR检测Fig.1 Picture of 47 clones

M，DL8000；泳道1～2，NdeⅠ/PstⅠ双酶切pGBKT7-P2；泳道3～4，NdeⅠ/PstⅠ双酶切pGBKT7。M， DL8000; Lane 1-2， pGBKT7-P2 enzyme digestion by NdeⅠ/PstⅠ; Lane 3-4， pGBKT7 enzyme digestion by NdeⅠ/PstⅠ.图2 酵母重组质粒双酶切电泳图Fig.2 Double digestion patterns of recombinant plasmid

A，模式图，pGADT7-RECT与pGBKT7-Lam互作为阴性对照，pGADT7-RECT与pGBKT7-53互作为阳性对照，pGBKT7-P2与pGBKT7互作为自激活验证；B，SD/-Trp/-Leu培养基；C，SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal培养基。A， Mode pattern， pGADT7-RECT interact with pGBKT7-Lam served as negative control， pGADT7-RECT interact with pGBKT7-53 served as positive control， pGBKT7-P2 interact with pGBKT7 served as auto-activation tests; B， SD/-Trp/-Leu medium; C， SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal medium.图3 pGBKT7-P2、pGBKT7载体自激活验证及毒性验证Fig.3 Autoactivation and toxicity testing of pGBKT7-P2 or pGBKT7

将靶标载体和诱饵载体共转入Y2HGold酵母感受态均能生长在营养缺陷培养基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)上，并且在加了X-α-Gal的缺陷培养基培养时酵母菌落变蓝明显，由此说明，TaTIFY、Ta14-3-3与P2在酵母体内存在互作关系(图4)。为进一步说明互作强弱，我们在培养基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)挑选了单克隆，并用无菌水做了梯度稀释。结果表明，含有TaTIFY与P2及Ta14-3-3与P2的酵母细胞在稀释至10-3倍时，仍能在筛选培养基SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal)上正常生长，与阳性对照基本一致(图5)。

表2 P2-pGBKT7为诱饵筛选到的互作基因信息

图4 利用酵母双杂交检测pGBKT7-P2与TaTIFY10A-pGADT7、Ta14-3-3-pGADT7相互作用Fig.4 Interaction analysis among pGBKT7-P2 and TaTIFY10A-pGADT7 or Ta14-3-3-pGADT7 in the yeast two-hybrid system

由此说明，TaTIFY、Ta14-3-3与P2存在较强的互作能力。

3 讨论

病毒与植物因子互作在病毒侵染过程中有着十分重要的功能[20]。因此，在病毒侵染植物的过程中，探索病毒蛋白与寄主因子互作机制尤为关键[21]。研究表明，病毒的运动蛋白与内质网或内质网衍生结构关系十分密切[22]。小麦黄花叶病毒P2通过参与重排寄主细胞内质网，从而促进病毒基因组在宿主的复制[23]。因此，通过探索与P2互作的蛋白，对研究WYMV的致病机理至关重要。

酵母双杂交技术是当今最为普遍的一种科研技术，不仅在研究蛋白间的互作和判定未知蛋白信息等方面有着重要的应用，而且操作方便快捷，试验结果可靠[24]。Oruetxebarria等[22]利用酵母双杂交技术，发现病毒复制酶Nib(nuclear inclusion protein B，Nib)与植物Rb有关的蛋白不存在互作关系，推测病毒RNA复制酶可能通过这些植物蛋白调控病毒RNA复制。Kong等[25]在拟南芥文库中，以病毒复制蛋白AL1为诱饵进行酵母双杂交试验，结果显示，AL1能与组蛋白H3(histone 3)、驱动蛋白(kinesin)和一个激酶(kinase)相互作用并发挥功能。本实验利用GATE-WAY克隆技术，成功地构建了小麦cDNA文库，不但能保证文库的质量，而且操作的方法简单、实用性高[26]。并且，本实验将P2基因构建到诱饵载体pGBKT7，在小麦的cDNA文库进行筛选，发现了18个与P2蛋白互作的候选寄主因子。其中大部分靶标已证实与植物的抗逆或生长发育相关。拟南芥AtUBPA2c参与了水杨酸信号通路，并可调控抗病相关基因的表达[27]；14-3-3能够调控细胞周期组织、植物的新陈代谢、蛋白质运输和激素信号传导等多种生理过程，在植株生长发育和逆境响应过程中表现关键作用[28]；拟南芥TIFY家族蛋白JAZ7通过调节植物的光合作用、氧化还原反应等参与植物的抗旱过程[29]；TaBOI属于RING型E3泛素化连接酶。研究表明，E3泛素化连接酶在植物抗病过程中发挥重要作用[30]。拟南芥E3泛素化连接酶ATL2和ATL4基因能够被几丁质等病程相关蛋白诱导表达[31]；在水稻中抑制E3泛素化连接酶XA21结合蛋白(XA21-binding protein 3，XB3)的表达导致植株对Xanthomonasoryzaepv.Oryzae表现敏感[32]。本研究中，我们筛选发现WYMV-P2可以与大量的小麦蛋白存在相互作用，推测P2可能通过与候选因子在植物体内发生互作，干扰了该蛋白介导的信号通路反应，从而促进了WYMV的侵染。但是，P2与候选靶标的互作关系还需要更多的实验加以证实，如双分子荧光实验、GST-Pull down实验等。此外，为了深入揭示P2如何影响寄主靶标蛋白的功能，我们还需要对候选蛋白的功能及其对病毒侵染的影响进行研究。总之，本研究通过酵母双杂交技术筛选出与WYMV-P2发生互作的小麦候选寄主因子，从中挖掘重要的小麦抗病相关基因并用于培育小麦抗病材料对小麦黄花叶病毒病的可持续控制具有重要作用。

pGADT7-RECT与pGBKT7-Lam互作为阴性对照；pGADT7-RECT与pGBKT7-53互作为阳性对照；A，SD/-Trp/-Le培养基和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His培养基；B，SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal培养基。pGADT7-RECT interact with pGBKT7-Lam served as negative control; pGADT7-RECT interact with pGBKT7-53 served as positive control; A， SD/-Trp/-Leu medium and SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His medium; B， SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His+X-α-Gal medium.图5 WYMV-P2与TaTIFY 10A-pGADT7、Ta14-3-3-pGADT7在酵母互作验证Fig.5 Interaction of WYMV-P2 with and TaTIFY10A-pGADT7/Ta14-3-3-pGADT7 in a yeast two-hybrid analysis