潜在益生乳酸菌分离和鉴定研究进展

汤回花，李 宏，陶慧玲，刘毕琴，王馨蕊，王瀚墨，史 巧*

（1.云南省农业科学院 农产品加工研究所，云南 昆明 650223；2.云南省农业科学院国际农业研究所，云南 昆明 650223）

乳酸菌是一类重要的益生菌，常占据并定殖于宿主肠道，调控并保持着宿主和体内微生物群之间的动态平衡。研究发现，乳酸菌具有促进营养成分吸收、提高人体免疫力、维持肠道菌群平衡等多种益生功能[1-3]。2014年，由国际益生菌与益生元科学联合会发布了关于益生菌的共识，其中突出强调益生菌的三个核心特征：①足够数量；②活菌状态；③有益健康功能[4]。联合国粮食及农业组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）与世界卫生组织（world health organization，WHO）推荐仅从人的胃肠道分离的乳酸菌可在食品中使用，并且应进行体外测试和体内实验来证实其益生功能。主要包括安全性，储存过程中的活性，对胃酸的抵抗力，对胆汁的耐受性，对肠上皮细胞的粘附性，抗菌物质的产生，刺激免疫反应以及影响代谢活动的能力[5]。益生乳酸菌的初步筛选还包括基因型和表型稳定性，质粒稳定性，碳水化合物利用模式，抗生素耐药性，对病原菌抑制作用以及免疫原性等测试[6]。此外，益生菌应易于大规模培养，并且能够抵抗制备过程中的技术操作，例如加热和低氧条件。

随着人们意识到健康饮食在促进人体健康和预防疾病方面具有重要作用，益生乳酸菌在普通食品、膳食营养补充剂和婴幼儿配方食品等领域均得到了广泛应用。来自ZION Market Research的数据显示，我国益生乳酸菌产业连续3年增长率在20%以上，预计2025年全球益生乳酸菌产业的产值将超过770亿美元，中国市场占比将超过25%。扩大益生乳酸菌的筛选范围和菌株高速准确鉴定有望在未来几年推动该行业的增长。故本文从潜在益生乳酸菌的分离及鉴定技术进行综述，以期为我国益生乳酸菌自主开发利用提供借鉴。

1 潜在益生乳酸菌分离来源

益生菌市场需求的大幅增加推动着国内外研究学者对优良益生乳酸菌菌株的筛选研究。目前我国商用食品益生乳酸菌来源于健康人体的胃肠道，但由于肠道内微环境为厌氧环境，与外界环境差异较大，并且人体肠道内菌群组成十分复杂，使用最佳的厌氧培养方法也很难对胃肠道内的乳酸菌进行有效分离。因此，寻找食品来源的益生乳酸菌已成为食品微生物学研究的热点。与来自肠道的益生菌相比，食品来源的益生乳酸菌更适应食品环境，易形成更好的感官品质。HAN Q等[7]对从哈尔滨干香肠中分离得到的4株菌（戊糖片球菌R1、短乳杆菌R4、弯曲乳杆菌R5和发酵乳杆菌R6）和发酵乳制品分离益生乳酸菌进行体外比较，发现这4株菌对人的胃肠道有良好的耐受性，并具有体外抗氧化作用，可用于食品加工中的备选益生乳酸菌资源。

1.1 母乳来源

母乳是婴儿营养的黄金标准，富含免疫因子、脂类、寡糖和激素等多种生物活性成分[8-9]。从母乳中分离出的益生乳酸菌主要有罗伊氏乳杆菌、格氏乳杆菌和屎肠球菌。RAJOKA M R等[10]从母乳中分离出乳杆菌并对其进行体外实验，发现其具有耐酸、耐胆盐、抗氧化性能以及抗生素耐药性。同时，他们发现被测试的乳杆菌对宫颈癌细胞有很好的抑制作用。REBECA A等[11]从母乳中分离出发酵乳杆菌CECT 5716、唾液乳杆菌CECT 5713可用于治疗乳腺炎，还发现乳腺炎患者经过相关益生乳酸菌治疗后，其乳汁中细菌数量显著减少且健康状况得到明显改善，并且发酵乳杆菌CECT 5716在2016年被国家卫计委列入《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。另外，研究发现在治疗胃肠道炎症时，直接摄入乳酸菌比抗生素效果更好，而且危险性和副作用几乎为零[12-13]。如今抗生素滥用现象普遍，使用国际公认最安全的益生菌来代替需要肝肾脏代谢的抗生素的研究变得十分重要，源于健康母乳的益生微生物可提高免疫和肠道健康，如能从母乳中分离筛选到有益微生物，利用其生产的健康食品具有非常广阔的商业前景。

1.2 动物乳及乳制品来源

自然发酵乳制品的制作和食用历经数千年的传承，加之不同的气候环境、地理因素以及不同的制作工艺，使得其中蕴藏的乳酸菌生物多样性极为丰富。这些乳酸菌经过长期的自然选择和驯化，不乏具有优良益生特性和生产特性的菌株，主要包括乳杆菌、乳球菌或链球菌属的细菌。从奶源中分离出的新的本土益生乳酸菌菌株因其许多健康益处而闻名，如骆驼奶或马奶，可以与商业菌株竞争[16]。RZEPKOWSKA A等[14]从有机乳清原料中分离出16株乳杆菌菌株，其中7株被鉴定为植物乳杆菌，其余为发酵乳杆菌。所有菌株均能利用碳水化合物并具有β-半乳糖苷酶活性，部分菌株还可以降低硝酸盐含量。许女等[15]从藏灵菇乳中筛选出一株植物乳杆菌Z4对羟自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有较好的清除效果，清除率分别达到75.2%和53.7%。

1.3 植物及其发酵制品

益生乳酸菌也可以从植物及其发酵产品中分离得到。XING Z等[17]从西藏青草籽粒中分离出具有较高胞外多糖产量的乳杆菌XL10，已被证明在体外和体内具有益生菌潜力。OLIVEIRA J S等[18]从发酵可可浆中分离出发酵乳杆菌TcUESC01和植物乳杆菌TcUESC02，通过检测小鼠口服沙门氏菌后的存活率，发现这两株乳杆菌对肠病原菌具有拮抗作用。AAB A等[19]从柑橘类水果分离出两株戊糖乳杆菌可以在低pH（3），胆汁盐（4%），NaCl（6%）和苯酚（0.6%）存在的条件下存活，能产生有益于人体健康的胆盐水解酶和β-半乳糖苷酶。刘之园等[20]从水果酵素中分离出产淀粉酶、DPPH自由基清除（91.46%）及产酸（13.14 g/L）能力强的副干酪乳杆菌B6，可作为优良菌株进行研究与开发。此外，发酵蔬菜食品中也含有丰富的乳酸菌，如传统的发酵卷心菜和黄瓜。ZIELIN′SKA D等[21]从腌渍样品中分离出38株乳酸菌，其中14株被鉴定为乳杆菌属。经筛选有10株被认为是安全的，具有益生菌功能特性，可作为益生菌备选菌株。

2 益生乳酸菌鉴定

作为供人类食用的益生菌产品，为了使益生菌功效和安全性得到保证，在开发使用过程中的鉴定技术至关重要。早期采用分子生物学方法对乳酸菌进行属、种水平鉴定，如16S～23S rRNA测序，变性梯度凝胶电泳，脉冲场凝胶电泳，扩增核糖体脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）限制性分析（amplified ribosomal deoxyribonucleic acid restriction analysis，ARDRA），DNA-DNA 杂 交（DNA-DNA hybridization，DDH），在很大程度上有助于分类鉴定乳酸菌[22]。20世纪60年代以来，使用DDH被称为分类学中的“金标准”，但是DDH存在着对亲缘关系较远的物种灵敏度不够以及工作量大、耗时长等缺点。此外，16S rRNA因其基因保守、稳定且不受水平基因转移的影响，成为细菌分类鉴定的重要依据从而得到了广泛应用，但是这种方法在区分两个相似性很高的近缘菌种或亚种时会引起偏差。HUYS G等[23]研究表明，超过28%的市售益生菌产品在菌株水平上被错误地标记，所以在菌株水平上正确识别对益生菌安全评估至关重要。随着新型微生物鉴定方法迅速发展和普及，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、全基因组测序、实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR）等技术能够在菌株水平上鉴定益生菌，下文主要介绍应用潜力较大的四种益生乳酸菌鉴定方法。

2.1 MALDI-TOF MS 快速鉴定和分类

MALDI-TOF MS是一种基于表型的方法，根据微生物特定蛋白质组学特征对其进行鉴定[24-25]。当该方法与特定的质谱峰结合时，可以实现亚种和菌株水平上的分类鉴定[26]，常应用于常规临床诊断，现在已扩展到食品安全、生物多样性和肠道微生物学[27-28]，如采用MALDI-TOF MS鉴定乳制品和肉制品中的乳酸菌[29-30]。HUANGCH等[31]使用MALDITOF MS通过乙醇/甲酸/乙腈进行蛋白质提取来快速鉴定干酪乳杆菌群菌株，结果显示MALDI-TOF MS鉴定与脱氧核糖核酸（DNA）测序、聚合酶链式反应（PCR）方法相比，具有更高的区分能力和更短的分析时间，可有效控制益生菌产品质量，但由于购买和运行MALDI-TOF MS的成本非常高，通常只用于实验室鉴定或结合其他方法如16S rRNA测序来区分种类相近的菌属。另外，该方法样品制备不易，需要新鲜、纯净的培养物和足够的细菌量（105～107个细胞）进行蛋白提取和分析。

2.2 SNPs-微量测序分析

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）是继限制性片段多态性和短串联重复序列外的第三代遗传标记，具有遗传稳定、数量多、检测片段短、可以高通量、自动化检测等特点。SNPs即微测序，是以荧光染料标记的双脱氧核苷酸（dideoxynucleotide，ddNTP）进行等位基因特异性引物延伸来检测SNP。每种荧光标记的ddNTP有唯一发射波长，然后将其转换为每个碱基的特定颜色。带有荧光标记的延伸产物可以通过毛细管电泳和自动测序技术进行可视化。HUANG C H等[32]通过使用dnaK基因序列设计了干酪乳杆菌组群的PCR引物对，进行SNPs-微量测序分析以鉴定属于干酪乳杆菌组群的物种，并与16S rRNA测序进行对比，发现利用dnaK基因可以清晰地区分干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、玉米乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。dnaK基因的平均序列相似性（87.8%）显著低于16SrRNA序列（99.1%）。因此，dnaK基因可以作为干酪乳杆菌的另一种分子系统发育标记，其分辨率高于16S rRNA。随后HUANG C H等[33]利用物种特异性PCR技术结合SNPs-微量测序分析实现鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌鼠李糖亚种鉴定，以dnaJ基因为靶点，建立物种特异性PCR引物。结果表明，该引物对鼠李糖乳杆菌具有特异性，并能明确地将鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌鼠李糖亚种区分，成功建立了一种快速、准确、经济的鼠李糖乳杆菌物种鉴别方法，可用于益生菌产品的质量控制。另外SNPs-微量测序分析可精确定位特定核苷酸位点，尤其是在单个反应管中同时筛选多个SNP时，短序列仅需40 min即可进行自动荧光毛细管电泳，因此这种方法比直接测序效率更高。

2.3 实时荧光定量聚合酶链式反应

RT-FQ-PCR是在传统的PCR技术上发展而来的，是指在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或内参基因对未知模板进行定量分析的方法。它不仅能判断某一基因的有无，还可以对其进行定性定量分析，从而用于佐证区分不同物种，并量化样品中的细菌浓度。常见的荧光化学物质有SYBRGreen荧光染料、TaqMan荧光探针和分子信标。SYBRGreen可以非特异性的与DNA双链结合，通过溶解曲线，确定PCR是否特异，并通过TaqMan荧光探针的引入实现荧光信号的累积与PCR产物形成进而对模板定量分析。如果已知菌株特异性序列，则可以直接通过RT-FQ-PCR技术对菌株进行检测和定量分析。MOSER A等[34]根据瑞士乳杆菌的苯丙氨酰-转移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）合成酶α亚基基因（pheS）序列设计特异性引物进行RT-FQ-PCR分析，建立了一种能够快速准确检测瑞士乳杆菌方法。孙畅等[35]通过对比RT-FQ-PCR与国标法，发现RT-FQ-PCR可快速、准确检测出发酵豆乳中植物乳杆菌和副干酪乳杆菌及其含量。陈嘉康[36]利用RT-FQ-PCR技术与叠氮溴化丙锭结合，可快速对泡菜中的目标菌株植物乳杆菌NCU116进行定性和活菌计数。RT-FQ-PCR是一种高度灵敏，特异和准确的方法，可同时检测和定量微生物群落中的细菌。与培养法相比，RT-FQ-PCR速度更快，设备较便宜，适合日常例行分析，加之不需要富集培养，还可以降低污染的风险，是一种对菌株进行特异性鉴定的理想方法[37]。

2.4 全基因组测序

全基因组测序技术经历了一到三代DNA 测序技术的演变。第一代双脱氧链终止法（Sanger）由于操作简便，应用最为广泛，以Sanger法为基础开发出多种测序技术。进入后基因组时代后，为满足对基因组进行大规模测序的需求，二代高通量测序技术被研究者所开发，主要原理为边合成边测序，主要包括Ion Torrent测序技术、罗氏454测序技术和Illumina测序技术。但在测序过程中，二代技术错误率较高。至今，测序技术已发展至第三代，大大缩短了运行时间，加大了读取长度[38]。目前，以二代和三代测序技术结合的方式完成全基因组测序是一种准确有效研究乳酸菌的方法[39]。HUANG C H等[40]分析两个新菌株（BCRC 81062T和BCRC 18859）的全基因组序列，采用直系同源基因的全基因组平均核苷酸一致性（orthologous average nucleotide identity，OrthoANI）估算平均核苷酸一致性（averagenucleotide identity，ANI），并使用基因组距离计算器（GGDC 2.0）进行数字DNA-DNA杂交，发现新菌株与密切相关菌株物种间相似度范围为7%～44%，因此证实了这两个菌株代表了一个新物种，其名称为Lactobacillus chiayiensissp。LI B等[41]从中国传统发酵乳制品中分离出瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）KLDS1.8701，通过全基因组序列分析鉴定出含有许多益生菌相关基因，同时体外实验和体内实验发现该菌株高度稳定，安全并且适合用于食品工业。

在已知某菌株全基因组序列的基础上，还可以开发该菌株的特异性PCR引物，进行PCR鉴定分析[42]；也可以直接从待测品中提取DNA生成全基因组数据来与已知菌株全基因组比对，证明是否为同一菌株；同时全基因组数据也可以用来衡量产品纯度，如某种加工产品被一种微生物污染了，那它的全基因组数据将会包含污染菌株的基因组序列数据，将该产品的全基因组数据与参考基因组数据库（如美国国立生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的DNA序列数据库）进行交叉比对来识别污染菌株。另外，还可以利用多菌株混合产品的全基因组数据来测量某种菌株的相对丰度。目前，利用全基因组测序来衡量细菌生存能力的领域正在快速发展，该技术基于细胞膜受损后细胞“死亡”这一假设，在待测菌株中加入一种化学物质，该物质不能渗透完整的（活细胞）细胞膜，只能渗透细胞膜受损（死细胞）的细胞。一旦进入这些“死亡”细胞，这些化学物质就会与DNA发生反应，使其无法进行测序[43]。这些方法的不断发展，有助于运用全基因组测序评估益生菌产品的稳定性和活力。

3 结语

在过去的几十年中，益生菌在休闲食品、保健食品和婴幼儿配方等食品中得到了广泛应用。随着消费者越来越意识到益生菌在促进人体健康和预防疾病中的重要性，近几十年来对益生菌补充剂的需求不断增长。因此，从适合的来源中分离并快速可靠地鉴定潜在益生乳酸菌菌株，进而筛选安全、高活性益生菌是未来研究趋势。为了确保产品质量安全，需要快速可靠的工具来鉴定和定量产品中的益生菌菌株。现在已经建立了微生物学方法和分子生物学等方法来鉴定益生菌。这些方法通常具有足够的特异性，可以鉴定种属水平的益生菌菌株，如MALDI-TOF MS 越来越多地用于鉴定细菌种类，但购买和运行MALDITOF MS的成本非常高，MALDI-TOF MS在微生物学中的未来应用将取决于数据库的扩展，例如兽医医学、植物病理学、食品安全、工业微生物学和药理学等领域。为了在这些研究领域中可靠地鉴定微生物，必须对相关参考物种和菌株进行分析，并将其纳入数据库中。分子生物学方法已成为鉴定、筛选和分析益生菌的有效工具，RT-FQ-PCR技术除鉴定外，还可用于细菌的定量分析，其快速、经济且样品易于处理，是细菌定量定性分析最常用方法之一。其次，目前全基因组测序应用广泛，能更快地筛选出具有生理特性和功能特性的菌株。根据乳酸菌适宜环境筛选特定用途的菌种，并运用现代技术将其有效鉴定将为新型益生菌开发及其在食品中的应用技术提供保障。