木犀草素对K562细胞增殖与凋亡的影响及其机制

彭艳辉，段智，李涛△

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）发源于造血干细胞，是血液系统的恶性肿瘤［1］。CML的主要特点在于特征性断点簇区域−c−abl癌 基 因1（breakpoint cluster region−c−abl oncogene 1，BCR−ABL）融合基因的形成，约90%的CML患者存在9号和22号染色体易位形成的BCR−ABL融合基因［1−2］。其表达的BCR−ABL融合蛋白作为一种酪氨酸激酶持续性激活下游增殖、分化等相关信号通路，从而导致疾病的恶化［2］。针对CML的治疗主要应用酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI），然而TKI对部分患者的治疗效果不明显［1］，进一步探索治疗CML的药物具有非常重要的临床意义。木犀草素（luteolin）为黄酮类化合物，是一种来源于植物的生物活性成分，具有抗氧化［3］、抗炎［4］、抗过敏［5］等多种生物学作用。作为传统的中草药成分之一，木犀草素在膀胱癌［6］、乳腺癌［7］、结肠癌［8］等癌症中均显示出抗肿瘤功效。然而，有关木犀草素在白血病中作用的研究尚少见。本研究旨在探讨木犀草素对CML K562细胞的作用及其潜在机制，为白血病药物筛选提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器木犀草素、Annexin V−PE/7ADD凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio公司，磷酸盐缓冲液（PBS）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、青−链霉素双抗购自美国Gibco公司，二甲基亚砜（DMSO）、CCK−8增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗B细胞淋巴瘤2蛋白（B−cell lymphoma−2，Bcl−2）、Bcl−2相关X蛋白（Bcl−2−associated X protein，Bax）、多 聚ADP核 糖 聚 合 酶（Poly ADP−ribose polymerase，PARP）、裂解的多聚ADP核糖聚合酶（Cleaved−poly ADP−ribose polymerase，Cleaved−PARP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase3）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved−Caspase3）、蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated−protein kinase B，p−AKT）、断 裂点 簇 区 蛋 白（Breakpoint cluster region，BCR）、c−abl癌基因1（c−ABL）抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗β−肌动蛋白（β−actin）抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；对应的羊抗兔、羊抗鼠酶标二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞培养箱（311型）、多功能酶标仪（JS−THERMO Varioskan Flash）、蛋白电泳仪（EI0001）购自美国Thermo Scientific公司；凝胶成像系统（FluorChem Q）购自美国ProteinSimple公司；流式细胞分析仪（MoFlo XDP）购自美国Beckman公司。

1.2 细胞培养CML K562细胞购自南京科佰生物科技有限公司，培养于含10%FBS、1%青−链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞培养至融合度80%～90%时进行传代。选取生长良好且处于对数生长期细胞用于实验。

1.3 CCK−8法测定细胞增殖情况取对数生长期K562细胞铺板于96孔板中，细胞密度为2×105个/孔。实验设木犀草素0、10、25、50、100μmol/L组，将木犀草素溶于DMSO配制为1 000μmol/L溶液，根据细胞培养时培养基的量分别加入不同量的木犀草素溶液使培养基木犀草素终浓度分别为10、25、50、100μmol/L，0μmol/L组仅加入DMSO，每种浓度设3个复孔。分别在细胞培养24、48、72 h后每孔加入10μL CCK−8溶液，于培养箱中继续孵育3 h，以酶标仪450 nm处测定细胞吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）=（对照孔A450−实验孔A450）/对照孔A450×100%。

1.4 流式细胞术测定细胞凋亡情况取对数生长期K562细胞加入6孔板中，细胞密度为1×106个/mL。实验设木犀草素0、25、50μmol/L组，每种浓度设3个复孔。培养48 h后收集细胞，加PBS 350×g离心5 min，洗涤细胞，弃上清。用Binding buffer重悬细胞，调整细胞悬液体积至1 mL，取100 μL重悬液分别加入5μL 7AAD和5μL Annexin V荧光染料，孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 Western blot检 测Bax、Bcl−2、PARP、Cleaved−PARP、Caspase3、Cleaved−Caspase3、AKT、p−AKT、BCR、c−ABL、BCR−ABL蛋白的表达将K562细胞接种于培养皿中，待细胞处于对数生长期，细胞密度80%时，在不同培养皿中加入木犀草素，调整终浓度分别为0、10、50、100μmol/L，继续培养48 h后350×g离心5 min，收集细胞，加入细胞裂解液冰上裂解收集细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。分别取不同浓度木犀草素处理后的蛋白80μg，行SDS−PAGE电泳2～2.5 h，转膜2 h将蛋白转至NC膜上，5%TBST配制的脱脂牛奶封闭1 h，孵 育 一 抗Bax（1∶1 000）、Bcl−2（1∶1 000）、PARP（1∶1 000）、Cleaved−PARP（1∶500）、Caspase3（1∶1 000）、Cleaved−Caspase3（1∶500）、AKT（1∶1 000）、p−AKT（1∶1 000）、BCR（1∶1 000）、c−ABL（1∶1 000）、β−actin（1∶5 000）抗体，4℃孵育过夜，随后回收一抗并以TBST洗涤膜3次，每次5 min，室温摇床孵育对应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）2 h，回收二抗，再次洗涤膜3次，每次5 min，最后加上适量的ECL超敏显色液化学发光显影。以β−actin为内参，用ImageJ软件分析目标蛋白和内参蛋白灰度值，相对表达量=目标灰度值/内参灰度值。实验重复3次。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD−t检验。不同时点多组间比较采用重复测量设计的方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草素抑制K562细胞增殖CCK−8检测结果显示，随木犀草素浓度增加及作用时间的延长，K562细胞增殖抑制率均呈增长趋势（P＜0.05），见表1。

2.2 木犀草素诱导K562细胞凋亡流式细胞仪检测结果显示，木犀草素0、25、50μmol/L组K562细胞的凋亡率分别为8.21%±0.55%、23.43%±1.50%和40.47%±2.97%，细胞凋亡率依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（F=206.100，P＜0.05），见图1。

2.3 木犀草素对凋亡相关蛋白表达的影响促凋亡蛋白Bax、Cleaved−PARP、Cleaved−Caspase3表达水平随木犀草素浓度的增加而升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。木犀草素0、10、50 μmol/L组PARP蛋白表达水平依次升高（P＜0.05），100μmol/L组与50μmol/L组差异无统计学意义。木犀草素50μmol/L组Caspase3蛋白表达水平高于0、10μmol/L组，100μmol/L组明显低于其余组（P＜0.05）。木犀草素50μmol/L组抗凋亡蛋白Bcl−2表达水平高于0μmol/L组（P＜0.05），与10μmol/L组差异无统计学意义；100μmol/L组明显低于其余组（P＜0.05），见图2、表2。

Tab.1 Comparison of the effect of luteolin on the proliferation between five K562 cell groups表1 木犀草素处理后各组细胞增殖抑制率比较（n=3，%，x±s）

Fig.1 The effect of luteolin on the apoptosis of K562 cells图1 木犀草素对K562细胞凋亡的影响

Fig.2 The effect of luteolin on apoptosis−related proteins图2 木犀草素对凋亡相关蛋白的影响

Tab.2 The expression levels of apoptosis-related proteins in four groups of K562 cells表2 各组K562细胞凋亡相关蛋白表达水平（n=3，x±s）

2.4 木犀草素对PI3K/AKT相关蛋白表达的影响木犀草素50、100μmol/L组p−AKT蛋白表达水平低于0、10μmol/L组，100μmol/L组低于50μmol/L组（F=55.170，P＜0.05），见图3。

2.5 木犀草素对BCR−ABL融合蛋白表达的影响木犀草素50μmol/L组BCR−ABL融合蛋白表达水平高于0μmol/L组，100μmol/L组低于0、50μmol/L组（Fc−ABL抗体=1 556.000，FBCR抗体=3 802.000，P＜0.05），见图4。

Fig.3 The effect of luteolin on the expressions of AKT and p−AKT protein in K562 cells图3 木犀草素对K562细胞中AKT、p−AKT蛋白表达的影响

Fig.4 The effect of luteolin on the expressions of BCR,c−ABL and BCR−ABL protein in K562 cells图4 木犀草素对K562细胞BCR、c−ABL以及BCR−ABL蛋白表达的影响

3 讨论

CML是一种克隆性骨髓干细胞疾病，主要特征为染色体易位产生融合蛋白BCR−ABL，激活一系列细胞增殖相关信号，加速细胞分裂，从而导致疾病的发生［1］。伊马替尼是目前治疗CML的首选药物，但其对部分CML患者的治疗效果欠佳［1，9］，进一步寻找CML的治疗药物具有重要的临床意义。

木犀草素是一种天然黄酮化合物，已有研究发现其对多种肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制作用［8,10−11］。本研究结果显示，木犀草素可抑制K562细胞的增殖，且其抑制作用呈剂量及时间依赖性；流式细胞术结果显示，木犀草素可诱导K562细胞的凋亡。王旭光等［12］研究亦显示，木犀草素可抑制K562细胞的增殖，与本研究结果一致。

凋亡是细胞程序性死亡的一种主要形式。在接收到上游凋亡信号后，细胞染色质固缩，细胞质起皱，DNA片段化降解，细胞最终死亡［13］。Bcl−2家族是调控细胞凋亡的重要信号蛋白家族之一［14］，Bax蛋白是线粒体应激诱导凋亡的重要组分。在受到凋亡性刺激后，Bax转位至线粒体膜，增加膜的通透性导致细胞色素C从线粒体释放，释放的细胞色素C进一步激活Caspase信号启动凋亡［15−16］。Bcl−2为抑制凋亡蛋白，能抑制线粒体细胞色素C的释放，从而抵抗凋亡性刺激导致的细胞凋亡［15−16］。本研究结果显示，木犀草素处理细胞后促凋亡蛋白Bax表达水平升高，提示木犀草素可诱导细胞凋亡。Caspase3是凋亡的关键效应因子之一，其对多种关键蛋白有裂解作用，裂解的Caspase3可以剪切PARP并诱导凋亡［17−18］。Caspase3和PARP的裂解在细胞凋亡中具有重要作用［13］。本研究结果显示，促凋亡蛋白Cleaved−Caspase3、Cleaved−PARP表达水平随木犀草素浓度的增加而升高，提示木犀草素可能通过激活Caspase级联进一步诱导了细胞的凋亡。与本研究结果类似，木犀草素在乳腺癌［7，11］、结直肠癌［8］等多种肿瘤中也可诱导细胞的凋亡，以上研究结果进一步证实木犀草素具有抗肿瘤作用。

PI3K/AKT信号通路是常见的信号通路之一，活化的AKT能抑制促凋亡蛋白的表达，保持细胞存活［19］。肿瘤中异常激活的PI3K/AKT信号在细胞的存活与增殖中发挥着重要作用［20−22］。Yao等［23］研究报道木犀草素可通过抑制PI3K/AKT信号抑制细胞增殖并诱导黑色素瘤细胞凋亡。本研究结果显示，木犀草素50、100μmol/L组p−AKT蛋白表达水平低于0、10μmol/L组，100μmol/L组低于50μmol/L组，提示在较高浓度的木犀草素（50、100μmol/L）作用下，K562细胞的PI3K/AKT信号通路受到了抑制；但在较低浓度的木犀草素（10μmol/L）并未显示出对该信号的抑制。结合流式细胞术细胞凋亡结果，笔者推测较高浓度（50μmol/L、100μmol/L）的木犀草素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制K562细胞的增殖及诱导细胞凋亡，但在较低浓度的木犀草素作用中PI3K/AKT信号很可能尚处于应激反应的前期，可能有其他的信号参与了细胞对凋亡相关蛋白的调控。

考虑到CML存在特异性的BCR−ABL融合蛋白［24］，本研究分析了木犀草素对BCR−ABL融合蛋白的影响。结果显示，50μmol/L的木犀草素作用K562细胞时BCR−ABL融合蛋白表达有所增加，而100μmol/L的木犀草素显著抑制了BCR−ABL蛋白的表达。BCR−ABL融合蛋白可导致不受控制的细胞增殖［25］，结合流式细胞术细胞凋亡结果，笔者推测不同浓度的木犀草素可应激性地调控K562细胞增殖，最终抑制细胞增殖。PI3K/AKT信号也是能被受体偶联的酪氨酸激酶所激活的下游信号之一［26−27］，结合BCR−ABL的表达结果，笔者认为高浓度（100 μmol/L）木犀草素可能通过某种途径降低了BCR−ABL蛋白的表达，参与负调控PI3K/AKT信号，从而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡；但在较低浓度的木犀草素作用下，其抑制增殖、诱导凋亡的机制仍有待进一步研究探索。

综上所述，木犀草素可抑制K562细胞的增殖，诱导凋亡相关蛋白表达并促进细胞的凋亡，其机制可能与调控BCR−ABL蛋白表达及PI3K/AKT信号通路有关。