酚酸物质对红松种子萌发及苗木生长和生理特性的影响

梁薇薇,陈立新,段文标,李亦菲,李少然,于颖颖

东北林业大学林学院,哈尔滨 150040

在森林生态系统中,酚酸类物质可作为植物参与竞争的直接或间接手段[1],为其提供竞争优势。酚酸类物质是目前公认的化感物质[2-3],可由植物挥发、淋溶、渗出和残渣的分解释放到环境中[4],通过许多潜在机制,如对植物根系的导水性和养分吸收的影响,导致矿物成分的变化[5],从而抑制植物生长,或者通过对植物光合作用、可溶性物质和抗氧化酶产生影响而导致植物生长受到抑制[6-7]。有研究发现[8-9],松树林内凋落物浸提液对松树种子萌发及幼苗生长有不同程度影响,其受凋落物浸提液浓度影响显著。

红松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)广泛分布于亚洲东部,是我国东北地区典型地带性顶极植被类型(针阔混交林)主要优势种和建群种。通过在凉水国家级自然保护区阔叶红松林内调查、观测及前期研究中发现,红松生长和更新受到不同程度地抑制。前期试验通过高效液相色谱法(HPLC)在阔叶红松林凋落物(椴树、红松、枫桦)及土壤中鉴定出13种酚酸类物质,其中苯甲酸、丁香酸、香草酸含量较高,因此,本试验假设这3种酚酸物质可作为化感物质影响红松生长更新。为验证所提假设,本试验通过室内模拟试验进行红松种子萌发和苗木盆栽试验,分析不同浓度3种酚酸溶液对红松种子发芽指标及红松苗生长指标和生理特性的影响,为探索阔叶红松林内化感作用机理及解决红松更新障碍问题提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年4月4日,于东北林业大学帽儿山实验林场取回低温窖藏并催芽的红松种子及3年生红松苗。其中,红松种子千粒重700 g,红松苗株高(22.0±3.8)cm,地径(5.1±0.8)mm。苯甲酸(BA：benzoic acid)、丁香酸(SA：syringic acid)和香草酸(VA：vanillic acid)购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 种子发芽试验

红松种子在蒸馏水中浸泡催芽6 h后,用10%次氯酸钠溶液进行表面消毒10 min,用无菌蒸馏水漂洗数次,然后用无菌去离子水冲洗3次后阴干。培养皿(直径9 cm)及纱布于高压灭菌锅中高温高压灭菌20 min,将两层灭菌纱布铺在洁净培养皿内,每培养皿中放入均匀饱满受体红松种子15粒。设苯甲酸、丁香酸、香草酸各3个浓度处理组(2、20、200 mg/L),试验中所设3个浓度处理均以前期试验测定凋落物及土壤中实际酚酸物质浓度为参考选取,以蒸馏水为对照(CK),每组重复3次,每培养皿内分别注入溶液15 mL(处理液添加量基于种子周围没有水膜)。培养皿用灭菌纱布覆盖,在(25±0.5)℃ 恒温箱(1/1000过氧乙酸消毒)中培养,每天滴入2 mL相应溶液对纱布进行湿润以保持其湿度。种子置床后第一粒种子萌发时间作为种子发芽起始时间,种子萌发标志以胚根突破种皮1 mm为标准,于每天中午记录发芽数,连续3 d没有种子萌发为止,计算种子发芽率、发芽势、发芽指数。将发芽种子每天补充2 ml处理液,直至种子脱壳,利用毫米刻度尺测量种子胚轴长、胚根长。

1.3 苗木生长试验

蛭石与珍珠岩(高温高压灭菌20 min)1:1混合装入200 × 250 mm塑料盆中(至盆高3/4处),将3年生红松苗移栽到盆中缓苗15 d。试验前,记录每株红松苗株高及地径(距地面1 cm处)位置,盆栽试验于实验室(平均温度25 ℃,平均日长12 h)自然光下进行,用2、20、200 mg/L苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液进行浇灌,对照(CK)浇灌等量蒸馏水,每处理重复5盆,每10 d浇灌250 mL相应溶液及5 mL Hoagland营养液,并将托盘中流出液倒回盆内,以确保各处理组土壤中酚酸含量与试验设计一致。在红松苗生长期间,根据基质湿度补充蒸馏水以防止水分胁迫,直到试验结束。2018年10月15日结束试验,将红松苗整株收获,进行生长指标(株高、地径、生物量)、光合色素(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)、抗氧化酶活性(过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD)、膜脂过氧化指标(丙二醛MDA)及可溶性渗透物质(可溶性糖、可溶性蛋白)含量测定。

1.4 测定方法

种子发芽势、发芽率、发芽指数按以下公式计算：发芽势(%)=前4 d种子发芽数/供试种子总数×100%[10]；发芽率(%)=试验期间种子发芽数/供试种子总数×100%[11]；发芽指数= ∑Gt/Tt[12],式中,Gt为第t天发芽种子数,Tt为发芽天数。光合色素含量采用分光光度法测定[13]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定,过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法测定[14]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[15]；可溶性糖含量采用硫酸-蒽酮显色法测定[16]；可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[17]。

1.5 数据统计分析

采用软件SPSS 19. 0对红松种子发芽指标、红松苗生长指标及生理特性指标进行单因素方差分析(ANOVA)及多重比较(Duncan’s test),用Sigmaplot 12.5进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同浓度苯甲酸、丁香酸和香草酸溶液对红松种子萌发的影响

不同浓度3种酚酸溶液均抑制红松种子萌发,其发芽率、发芽势及发芽指数均显著低于CK(P<0.05)。酚酸溶液浓度变化对红松种子发芽势及发芽指数影响差异均不显著,对发芽率影响差异显著(P<0.05),其中,20 mg/L BA、VA溶液和200 mg/L SA溶液对红松种子发芽抑制效果强于其他浓度处理组,发芽率仅为64.45%、57.78%和53.33%(表1)。

不同浓度3种酚酸对红松种子胚轴长及胚根长影响差异不显著。红松种子胚根受3种酚酸溶液影响强于胚轴,其中,BA浓度2 mg/L、20 mg/L时促进胚根生长,200 mg/L时抑制胚根生长,不同浓度SA溶液均促进胚根生长,而VA溶液对胚根影响表现为低浓度抑制,高浓度促进(图1)。

表1 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松种子发芽指标的影响

图1 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松种子胚轴长、胚根长的影响Fig.1 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on hypocotyl length and radicle length of Pinus koraiensis seeds不同小写字母表示同种酚酸不同浓度间差异显著(P < 0.05)；CK：对照组 control；BA：苯甲酸 benzoic acid；SA：丁香酸 syringic acid；VA：香草酸 vanillic acid

2.2 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗生长指标的影响

各处理组株高、地径、生物量增加量均低于CK,表明不同浓度BA、SA和VA溶液对红松苗生长(株高、地径)及物质积累(生物量)具有抑制作用。酚酸浓度变化对红松苗株高和地径影响差异均不显著,但对生物量、根干重和茎干重影响差异均显著(P<0.05)。其中,VA溶液对红松苗株高抑制作用强于其他处理组,SA溶液对地径抑制作用强于其他处理组。200 mg/L BA溶液对红松苗生物量增加抑制作用强于其他处理组。20 mg/L BA溶液抑制红松苗地上部分生长,而促进地下部分物质积累。BA溶液各处理组根茎比均高于CK。2 mg/L、20 mg/L SA溶液和VA溶液处理组根茎比低于CK,200 mg/L处理组高于对照(表2)。

2.3 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗针叶光合色素含量的影响

BA、SA和VA溶液处理红松苗对其针叶叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素均有一定影响。其中,不同浓度BA溶液处理红松苗后,针叶叶绿素a含量均低于CK,且含量差异显著(P<0.05)。SA溶液对针叶叶绿素a含量影响为中、低浓度抑制,高浓度促进,而VA溶液作用与之相反。不同浓度BA溶液处理红松苗后,其针叶叶绿素b含量均低于CK且含量差异不显著。20 mg/L SA溶液抑制针叶叶绿素b产生,其他浓度处理组针叶叶绿素b含量与CK差异均不显著；中浓度 VA溶液对针叶叶绿素b抑制作用强于其他浓度。不同浓度BA溶液处理组针叶类胡萝卜素含量均低于CK,且浓度变化对其含量影响差异显著(P<0.05)。SA溶液对针叶类胡萝卜素含量影响为中、低浓度抑制,高浓度促进,而VA溶液为中、低浓度促进,而高浓度抑制。20 mg/L SA溶液对叶绿素a、叶绿素b影响强于其他处理组,其含量仅为CK的56.47%、62.07%。20 mg/L BA、SA和VA均对类胡萝卜素影响强于其他处理组,其含量分别为CK的57.14%、61.90%、57.14%(表3)。

表3 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗光合色素的影响

2.4 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗针叶抗氧化酶系统及膜脂过氧化的影响

不同浓度BA和VA溶液对红松苗针叶POD活性影响显著(P<0.05),不同浓度SA溶液对POD活性影响不显著。BA溶液随浓度升高对POD活性抑制作用减弱,而SA溶液随浓度升高对POD活性抑制作用增强。不同浓度3种酚酸溶液对CAT活性影响整体与对POD活性影响一致。3种酚酸溶液对SOD活性影响除200 mg/L BA溶液抑制其活性外,其余各处理组均增加SOD活性,其中BA各浓度处理组针叶SOD 活性显著高于CK,2 mg/L BA溶液对SOD活性促进作用强于其余处理组,且高于CK组SOD活性13.6%(图2)。

图2 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the antioxidant enzyme activity of Pinus koraiensis seedlings不同小写字母表示同种酚酸不同浓度间差异显著(P < 0.05)；下同；POD：过氧化物酶 peroxidase；CAT：过氧化氢酶 catalase；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase

图3 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗MDA含量的影响 Fig.3 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the MDA content of Pinus koraiensis seedlingsMDA：丙二醛 malondialdehyde

不同浓度BA、SA和VA溶液均显著增加红松苗针叶MDA 含量,MDA含量随BA溶液浓度增加表现为先增加后降低,20 mg/L BA溶液对针叶MDA合成的促进作用强于2 mg/L和200 mg/L。MDA含量随SA和VA溶液浓度增加而增加,200 mg/L SA对MDA合成的促进作用高于其他处理组,且高于CK组MDA含量70.51%(图3)。

2.5 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗针叶渗透调节物质的影响

不同浓度VA溶液、SA和VA混合溶液对红松苗针叶可溶性糖及可溶性蛋白含量影响显著(图4)。针叶可溶性糖含量随BA溶液浓度升高而逐渐增加,而可溶性蛋白含量为CK>200 mg/L>2 mg/L>20 mg/L。SA溶液处理红松苗后,针叶可溶性糖含量为20 mg/L>2 mg/L>CK>200 mg/L,可溶性蛋白含量均高于CK。VA处理红松苗后,针叶可溶性糖含量为20 mg/L>CK>2 mg/L>200 mg/L,可溶性蛋白含量为CK>2 mg/L>200 mg/L>20 mg/L。其中,200 mg/L BA对针叶可溶性糖含量产生的促进作用显著强于其他处理组,而200 mg/L VA溶液对针叶可溶性糖含量产生的抑制作用明显强于其他处理组。

3 结论与讨论

3.1 酚酸物质影响种子萌发

酚酸类物质对种子萌发的影响是通过复杂的生化过程介导实现的。已有大量研究表明,酚酸抑制种子发芽[18-21]。本实验结果与前人研究一致,BA、SA、VA溶液均对种子萌发存在抑制作用,且对种子萌发的抑制作用强于对胚轴及胚根长的影响。向日葵(HelianthusannuusL.)叶片水提物通过抑制白芥(SinapisalbaL.)种子内肽链内切酶和异柠檬酸裂解酶活性,干扰种子内部储存蛋白质和脂肪酸降解,进而阻碍种子对O2的吸收,抑制ATP产生,从而干扰种子能量代谢,最终抑制种子萌发[22]。激素在种子萌发中发挥重要作用,不同激素协同或拮抗调控着植物生长发育[23-25]。Shu等[26]和Holdsworth等[27]研究表明,赤霉素促进种子萌发,而脱落酸抑制种子萌发。Muscolo等[28]研究了不同森林土壤中提取的低分子酚类物质对落叶松(Pinuslaricio, Poiret, spp calabrica)种子萌发及其萌发过程中呼吸酶和磷酸戊糖氧化途径酶活性的影响,发现所有酚酸对落叶松萌发均有抑制作用,且种子萌发受抑制与糖酵解酶和氧化磷酸戊糖途径酶的活性密切相关。由此可见,BA、SA、VA溶液对红松种子萌发的影响可以通过抑制胚胎生长、破坏细胞结构、干扰种子中活性氧的产生和积累、影响种子萌发过程中酶活性和代谢途径、打破种子内源激素平衡等多种途径来实现。

图4 不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗可溶性物质含量的影响Fig.4 Effects of different concentration of BA, SA, VA solution on the soluble matter content of Pinus koraiensis seedlings

3.2 酚酸物质影响幼苗生长及生理特性

已知化感物质通过改变植物代谢过程而导致植物生长减缓[29-30]。其中,酚酸类物质可影响植物体内吲哚乙酸(IAA)浓度,调节参与IAA合成或分解的酶的活性,IAA通过改变细胞壁伸展性和通透性引起细胞分裂,因此,酚酸类物质可以在完整植株茎伸长、细胞分裂及分化过程中发挥调控作用,引起植物生物量积累的变化[16]。Bi等[31]研究9种酚类化合物对西洋参(PanaxquinquefoliusL.)幼苗根茎生长的抑制作用,其中水杨酸、肉桂酸、香豆酸、香草酸、丁香酸均能显著抑制其幼苗根茎生长。本试验中,不同浓度3种酚酸均可导致红松苗生物量积累减少,其中,SA、VA溶液对红松苗株高及地径的抑制强于BA,BA溶液对地下部分物质积累的抑制作用弱于其他处理组。同时,不同浓度酚酸溶液处理红松苗使针叶叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量出现不同程度减少。叶片光合色素在植物光合作用中发挥极为重要的作用,其含量降低将导致光能吸收及传递受阻,最终引起光合速率下降[32]。Nimbal等[33]研究认为,化感物质能有效抑制光系统Ⅱ中电子受体QA和QB之间的电子传递,进而影响光合作用。Baziramakenga等[6]研究结果表明,低浓度苯甲酸和肉桂酸可以增加大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)叶绿素含量,而高浓度则产生相反效果。叶绿素含量与植物生物量积累密切相关[34],叶片叶绿素含量降低会限制光合速率和光合产物的积累,从而降低植物的总生长量[22,35],因此,红松苗针叶叶绿素含量减少是导致红松苗生物量积累受抑制的原因之一。

不同浓度3种酚酸处理红松苗后,其针叶中POD、CAT活性受到显著抑制,SOD活性增加。SOD清除植物体内超氧化物阴离子并产生 H2O2[36],POD和CAT将红松苗体内过多H2O2清除从而降低活性氧的毒害作用[37-38],但由于酚酸处理使红松苗体内抗氧化系统酶活性发生改变致使其不能保持原有正常水平,从而破坏了活性氧产生与清除之间的平衡[39-41]。活性升高的SOD将O2-转化为 H2O2时,活性下降的POD、CAT无法清除大量累积的H2O2以确保红松苗体内活性氧代谢系统的平衡,导致过量H2O2累积在红松苗体内加剧了膜脂过氧化,使膜结构和功能遭到破坏,引起一系列生理生化代谢紊乱,导致伤害发生,对红松苗机体形成氧化损伤,作为渗透调节物质的可溶性糖及可溶性蛋白含量升高正是3种酚酸对红松苗机体氧化损伤结果的体现。MDA作为氧化伤害和脂质过氧化的主要产物,具有很强的毒性,可抑制蛋白质合成或导致酶活性丧失[42]。因此,从MDA含量显著增加也可看出不同浓度苯甲酸、丁香酸、香草酸溶液对红松苗产生较大程度伤害,红松苗因氧化损伤致使其生长受抑制,生长状况变差。由此可知,苯甲酸、丁香酸、香草酸通过破坏红松苗体内抗氧化系统而抑制红松苗生长。

酚酸胁迫条件下,植物细胞会通过积累渗透调节物质(如可溶性糖、可溶性蛋白等),以调节细胞内渗透势、维持水分平衡及细胞膜正常结构[43]。可溶性糖不仅作为细胞的代谢能源和结构组成成分,还是调节植物生长发育过程中的各种信号[44]。糖信号途径与胁迫途径相互作用,以调节植物的代谢反应[45-46]。可溶性糖含量的波动是化感胁迫过程中常见的现象[47]。而由于蛋白质相对合成速率减小,现有可溶性蛋白质大量分解为游离氨基酸,用于调节渗透压并提供代谢能源,从而造成可溶性蛋白含量降低[48-49]。本试验中,不同浓度BA、SA、VA溶液对可溶性糖及可溶性蛋白含量影响显著,其中,红松苗为平衡3种浓度BA溶液及20 mg/L SA和VA溶液的化感胁迫作用而积累可溶性糖,使可溶性糖含量增加,而红松苗为调节不同浓度 BA、VA溶液对其产生的化感作用,导致红松苗针叶中可溶性蛋白含量减少。不同浓度酚酸溶液对红松种子萌发及苗木生长的影响存在较大差异性,可能是由于红松在不同生育时期对酚酸感应程度不同造成。

本试验证实了先前提出的假设,即BA、SA、VA在阔叶红松林生态系统中可能作为化感物质影响红松种子萌发及苗木生长。而在自然生态环境中,化感作用是化感物质综合作用的结果,因此,研究化感物质间的化感综合效应及设计合理的野外实验,对进一步正确了解影响阔叶红松林中的化感作用机理及解决红松更新障碍问题具有更重要的意义。