长链非编码RNA与mRNA在急性髓性白血病中的异常表达及其功能初探

田 薇，方 延 ，吴晗恬，吉布强，夏昭林

(1.新疆医科大学公共卫生学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.复旦大学公共卫生学院，上海 200032；3.山东省临沂市人民医院血液科，山东 临沂 276100)

急性白血病按照法、美、英分型系统(French-American-British classification systems，FAB)分型，主要分为急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴细胞白血病。其中AML是以骨髓和外周血中未成熟骨髓干细胞恶性增生为特征，并具有高度异质性的恶性肿瘤，发生机制尚在研究中。由于AML治愈率不高，且存活率低，治疗后存在复发的特点，因此研究和探索其分子生物学机制，发现新的生物标志极其重要。

近年来长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)逐渐成为表观遗传研究热点。以往认为lncRNA 没有功能，最新研究表明其在基因组中被广泛转录并在基因调节中起重要作用，lncRNA可能存在序列和空间结构上的异常、表达水平的异常及与结合蛋白相互作用的异常等，从而导致基因调节异常而发生疾病。目前lncRNA 最重要的发现是可能与恶性肿瘤的发生相关，不少研究显示在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌中lncRNA的表达水平有明显变化。

LncRNA 在血液肿瘤发生过程中所起的作用目前尚不清楚，其分子遗传及表观遗传学机制还需要进一步探讨。本研究采用lncRNA 基因芯片筛选AML 患者与健康对照组人群外周血中差异表达的lncRNAs 及mRNAs，并对所筛选出的差异表达lncRNAs和mRNAs进行基因本体(gene ontology，GO)分析和通路分析，探讨可能的分子功能及差异表达基因可能所在的细胞通路，对AML中的差异基因进行生物信息学的初步功能分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集AML患者及健康对照组各6例人群外周静脉血。白血病患者男性4名，女性2名，平均年龄(46.8±9.54)岁；健康对照组男性4 名，女性2 名，平均年龄(47.5±8.09)岁；两组选取的样本年龄和性别匹配。

1.2 RNA提取

经知情同意后，取患者及健康对照组人群外周静脉血2 mL，常规分离淋巴细胞，按照miRNeasy Mini Kit(QIAGEN，GmBH，Germany)说明书抽提总RNA，再经NanoDrop ND-2000 分光光度计(Thermo，US)及 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies，US)检测RNA 的浓度、纯度及完整性。样本

D

(260)/

D

(280)值在1.8～2.1 之间认为RNA 样本质量符合要求。检测合格的RNA再进行芯片实验。

1.3 lncRNA芯片实验

本实验样本由上海伯豪生物技术有限公司采用Agilent 4×180 K lncRNA 芯片(Agilent，US)同时检测lncRNA 和 mRNA，lncRNA 数目 63 431，mRNA 数目39 887。质检合格并纯化后的总RNA 经过荧光标记，在滚动杂交炉中进行芯片杂交，扫描并采集信号，最终获得lncRNA及mRNA表达量。

1.4 差异基因筛选和分析

采用Agilent Microarray Scanner(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US)，软件设置染料通道：绿色Scan resolution=3 μm， PMT 100% ， 20 bit。 用Feature Extraction software 10.7(Agilent technologies，Santa Clara，CA，US) 读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies， Santa Clara，CA，US)进行归一化处理，所用的算法为Quantile。本次实验设定差异表达的标准为差异倍数(fold change，FC)≥2，

P

＜0.05。

1.5 差异基因聚类分析

1.5.1 散点图绘制

芯片的原始数据经过标准化处理，以2 为底数取对数值后绘制散点图，用于评估两组数据总体分布情况。散点图中的所有点代表芯片上的所有探针，在二维平面中该点的位置由X轴坐标和Y 轴坐标确定。X 轴表示急性髓性白血病组标准化后点的信号值，Y 轴表示对照组标准化后点的信号值。当探针点在两张芯片中信号值差异倍数=1时，点落在图形

y

=

x

直线即中位线上方；当探针点在两张芯片中信号值差异差异倍数＞2时，则该点落在图形中位线两侧45°线之外。

1.5.2 火山图绘制

芯片数据进行组间比较，通过筛选FC 以及

t

-检验得到的

P

值来确定显著性差异的探针。火山图在同一平面内展示了满足上述两条件的探针数目及分布。在火山图中，纵坐标为-lg

P

值。横坐标为log(FC)，正号代表了基因表达上调，负号代表基因下调。

1.5.3 聚类热图绘制

对样本和基因分别进行分级聚类之后，通过热图表现基因在不同样本中表达情况的直观图形。

1.6 生物信息学分析

对差异表达的基因进行GO 分析和京都基因和基因组百科全书分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)。将差异表达基因上传至数据库(http://www.geneontology.org)进行GO分析，同时上传至数据库(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行KEGG分析预测可能的信号通路。

2 结 果

2.1 lncRNA芯片结果

对完成杂交的12个样本芯片进行扫描，结果每张芯片信号均无边缘化效应，均匀清晰。

2.2 表达差异基因筛选

结果显示，急性髓性白血病组与健康对照组相比，差异表达的lncRNA 有3 256个，其中1 161个表达上调，2 095 个表达下调；差异表达的mRNA 有3 544 个，其中1 950 个表达上调，1 594 个表达下调。表达上调和下调各前20位分别见表1和表2。

表1 急性髓性白血病组表达上调的lncRNAs和mRNAs(前20位)

表2 急性髓性白血病组表达下调的lncRNAs和mRNAs(前20位)

2.3 差异基因分布情况

散点图见图1。图中的每个点代表一个探针信号，X轴为对照组，Y轴为急性髓性白血病组，X轴和Y 轴数值分别对应探针信号在两组样本中的强弱，图中红色及绿色信号点表示基因表达量具有显著差异的基因。火山图见图2。图中越靠近左下角和右下角的数据

P

值越小，FC值越大，差异越显著。

2.4 差异基因层级聚类

对白血病组及对照组筛选出的差异表达的lncRNAs 及mRNAs 进行分级聚类，结果见图3，从图中可以看到每个基因在不同分组中的表达量差异分布。红色表示表达上调，绿色表示表达下调。

图1 LncRNA和mRNA散点图

图2 LncRNA和mRNA火山图

图3 LncRNA和mRNA聚类热图

2.5 生物信息学分析

与对照组比较，急性髓性白血病组的差异表达基因主要富集在化学刺激感受、有丝分裂细胞周期的G1/S转变、炎症反应等；差异表达基因富集的前10个GO条目见表3，差异基因的所有富集GO条目见图4。

急性髓性白血病组与对照组比较的差异表达基因主要富集在移植物抗宿主反应疾病、细胞循环及人类嗜T淋巴细胞病毒I型感染等通路上，差异表达基因富集的前10 个通路见表4，差异基因的所有富集通路见图5。

3 讨 论

LncRNA 参与了包括X 染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录干扰、转录后调控、核内运输等多种重要的调控过程，与细胞内很多生命活动密切相关。研究发现lncRNA在多种恶性肿瘤中表达异常，如lncRNA HOXA11-AS在肝癌组织中表达上调，lncRNA HOTAIR 在弥漫性大B细胞淋巴瘤中高表达，lncRNA KCNMB2-AS1 在胃癌组织中高表达。多项研究均显示，肿瘤的发生与lncRNA异常表达有关。史利欢等在体外细胞试验中也发现，lncRNA HIT 可通过抑制QKI 蛋白(Quaking QKI)的表达进而上调 Sox2 及 Oct4 的 mRNA 及蛋白表达，从而导致人急性淋巴细胞白血病细胞系SUP-B15对治疗该病的常用药物伊马替尼产生药物抵抗。由此可见，lncRNA在白血病发生及后续治疗过程均可能产生调控作用，因此建立白血病lncRNA 差异表达谱极其重要。

表3 急性髓性白血病与对照组差异表达基因富集的前10个GO条目

图4 急性髓性白血病组与对照组差异基因GO分析

表4 急性髓性白血病组与对照组差异表达基因富集的前10个通路

图5 急性髓性白血病组与对照组差异基因的KEGG分析

本研究采用lncRNA 基因芯片筛选急性髓性白血病与健康对照组外周血中lncRNAs和mRNAs的差异表达。结果显示急性髓性白血病组与健康对照组相比，差异表达的lncRNA 有3 256个，其中1 161个表达上调，2 095个表达下调；差异表达的mRNA有 3 544个，其中1 950个表达上调，1 594个表达下调。此结果提示差异表达基因与急性髓性白血病的发生可能有关，但仍需进一步的实验进行探讨。

此外，本研究对筛选出的差异表达lncRNAs 和mRNAs进行了GO分析和KEGG分析。GO分析结果显示，差异表达基因主要富集在化学刺激感受、有丝分裂细胞周期的G1/S转变、炎症反应等。表明差异表达基因在急性髓性白血病的发生过程中，调控细胞有丝分裂过程，对细胞增殖和凋亡产生异常影响，为急性髓性白血病的发生机制提供基因水平的依据。研究显示，lncRNA可能通过调控miRNA进而对细胞增殖和凋亡起到调控作用。白血病的发生与造血干细胞的增殖和凋亡异常关系密切。KEGG 分析结果显示急性髓性白血病组与对照组比较的差异表达基因主要富集在移植物抗宿主反应疾病、细胞循环及人类嗜T 淋巴细胞病毒I 型感染等通路上，为后续研究提供依据。目前多项研究发现lncRNAs 参与肿瘤发生相关的多种信号通路，如增殖信号通路、抑癌基因信号通路、细胞存活信号通路、运动信号通路等。Trimarchi等研究发现lncRNA LUNAR1 可能被Notch1 致癌基因诱导从而上调生长因子1 的受体表达，使得细胞异常增生导致急性淋巴细胞白血病的发生。

综上所述，恶性血液肿瘤与lncRNA 的异常表达密切相关。本文通过对急性髓性白血病组与健康对照组差异表达lncRNAs和mRNAs进行筛选，建立了差异表达lncRNAs 表达谱；研究结果为探索急性髓性白血病发生的新标志物及早期诊断提供可靠的线索，为后续研究奠定了基础。