基于ITS 序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

胡亮，方磊，李瑞莲，王湘波，周明

湖南省药品检验研究院，湖南药用辅料检验检测中心，湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001

土牛膝最早记载于《本草纲目》，指各地野生的牛膝，为苋科植物牛膝Achyranthes bidentataB1.的干燥根，其功效为“活血散瘀、祛风利尿，坠胎”［1］；肖步丹《岭南采药录》［2］中记载土牛膝的来源之一为粗毛牛膝Achyranthes aspera L.的根。土牛膝作为西南地区瑶族和土家族常用的民族药，应用十分广泛，但未有国家统一的药材标准，其中《湖南省中药材标准》2009 年版、《贵州省中药材标准》2003 年版收载的植物基原为苋科植物粗毛牛膝AchyranthesasperaL.的干燥根及根茎；《江苏省中药饮片炮制规范》1980 年版收载了3 个基原，分别为粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝；现行其余质量标准收载基原均为野生牛膝［3-4］。土牛膝的现行质量标准包括性状、显微鉴别和薄层色谱鉴别项目，通过品种考证、药用资源分布调查发现，3 种土牛膝药材外观形态较相似，不易区分，存在不同基原混用的情况。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，植物DNA 条形码被大量应用于不同基原药材的鉴定，陈士林等［5］首次提出将ITS2 序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列。DNA 条形码鉴定技术在中药药材鉴定中具有不受个体形态特征、药用部位、鉴定经验等限制的优点，克服了传统鉴定方法的诸多缺陷［6-10］。其中植物核糖体DNA 内转录间隔区（rDNA/ITS 区）序列进化速率快，可以提供丰富的变异位点和信息位点［11］。本研究首次应用ITS 和MatK 条形码对3 种植物基原土牛膝药材及其混伪品（川牛膝、广东土牛膝）进行鉴定研究，为土牛膝的快速准确鉴定提供新的技术手段。

1 仪器与试药

植物基因组DNA 提取试剂盒（Plant Genomic DNA kit，TIANGEN）；2×Taq Master Mix 缓冲液（GK8006，GENEray）；ExRed（ZS203-1，庒盟生物）；琼脂糖（50002，Lonza）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司合成），ITS 引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），MatK引物（MatKF：5'-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3'；MatKR：5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'）。

PCR 仪：ABI VERITI；分 析 天 平：Mettler AB135-S；MM400 球磨仪：德国Retsch 公司；纯水仪：美国Millipore 公司；Nano Value 微量紫外分光光度计；电泳仪：EPS-301，美国Amersham 公司；全自动凝胶成像系统：英国Syngene 公司。

2 材料

本次研究共收集30 份样本，包括5 个物种。其中实验样本24 份（表1），包含粗毛牛膝、野生牛膝、柳叶牛膝、川牛膝和广东土牛膝，实验材料由湖南省野生动植物司法鉴定中心进行鉴定。其余4 条ITS和2 条MatK 研究序列来自GenBank，ITS 序列包含野生牛膝2 条（登录号KX055976、KX055977），柳叶牛膝1 条（登录号MG730614），川牛膝1 条（登录号KC898550）；MatK 序列包含野生牛膝2 条（登录号MH659904、MH658983）。

表1 土牛膝及其混伪品样品信息

3 方法

3.1 DNA 提取

研究样品经75%乙醇擦拭表面，称取50 mg，在MM400 球磨仪（德国Retsch）上进行研磨，用天根植物基因组DNA 提取试剂盒提取DNA。

3.2 PCR 扩增和测序

PCR 反应体积为20 μL，使用ITS 和MatK 序列的通用引物对样品DNA 进行扩增，其反应条件为：95 ℃变性5 min，再进行35 个循环（95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min），最后72 ℃延伸7 min。反应体系为2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正反向引物（2.5 μmol/L）各0.4 μL，模板DNA 1 μL，其余用灭菌超纯水补至20 μL。通过ABI3730XL 测序仪对纯化后的PCR 产物进行双向测序。

3.3 数据分析

应用软件CodonCode Aligner V6.0 对序列峰图进行校对拼接，去除引物区及低质量序列，获得ITS序列和MatK 序列。利用软件MEGA 6.0 进行种内种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离分析，用NJ（邻接）法构建系统聚类树对土牛膝及其混伪品进行鉴定分析。

4 结果与分析

4.1 土牛膝及其混伪品药材DNA 提取与PCR 扩增

研究样品采用植物基因组DNA 提取试剂盒并做适当调整，提取的样本DNA 使用Nano Value 微量紫外分光光度计进行纯度测定。通过ITS 和MatK引物进行PCR 扩增，电泳条带清晰，其中ITS 扩增片段约750 bp，为单一条带；MatK 扩增片段约780 bp，见图1。

图1 土牛膝药材及其混伪品电泳图

4.2 土牛膝及混伪品药材ITS 序列种内及种间变异分析

使用MEGA 6.0 软件对样品ITS 序列进行变异位点分析，粗毛牛膝与柳叶牛膝、野生牛膝存在28～32 个变异位点，变异率为4.25%～4.86%；粗毛牛膝和柳叶牛膝均只有一个单倍型；野生牛膝有2 个单倍型，2 个单倍型之间有1 个碱基差异，为418 位的C-A 取代；粗毛牛膝与川牛膝存在75 个变异位点，部分碱基有缺失，川牛膝只有一个单倍型；粗毛牛膝与广东土牛膝存在150 多个变异位点，部分碱基有缺失，广东土牛膝存在一个单倍型，不同基原土牛膝与混伪品川牛膝、广东土牛膝碱基差异较大，易于区分。

粗毛牛膝与柳叶牛膝的种间最大K2P 为0.051，与野生牛膝的种间最大K2P 为0.044，柳叶牛膝和野生牛膝的种间最大K2P 为0.010；3 种植物基原的土牛膝（粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝）与川牛膝的种间K2P 范围为0.111～0.121、与广东土牛膝的种间K2P 范围为0.415～0.444。土牛膝各基原间种内最大K2P 小于种间最小K2P，有利于不同基原土牛膝的区分，同时与混伪品川牛膝、广东土牛膝K2P 较远，区分明显。

4.3 土牛膝药材Matk 序列种内及种间变异分析

用MEGA 6.0 软件对样品MatK 序列进行变异位点分析，粗毛牛膝与柳叶牛膝、野生牛膝存在5个变异位点，变异率为0.61%；粗毛牛膝和柳叶牛膝均只有一个单倍型，野生牛膝有2 个单倍型，2个单倍型之间有2 个碱基差异，为232 位的G-C 取代和621 位的C-T 取代。粗毛牛膝与野生牛膝、柳叶牛膝的种间平均K2P 均为0.006，柳叶牛膝和野生牛膝的种间平均K2P 为0.001；不同基原土牛膝之间种间K2P 较小，不利于物种的鉴别。

4.4 土牛膝药材及其混伪品NJ 树鉴定

从基于ITS 序列建立的聚类树种可看出，不同植物基原粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝聚为独立的一支，且支持率高，并呈现较好的单系性；混伪品川牛膝和广东土牛膝聚为独立的一支，呈现较好的单系性，与不同基原土牛膝能够进行有效区分，见图2。

图2 基于ITS序列建立土牛膝与其混伪品的NJ树图

基于MatK 序列建立的聚类树种可看出，粗毛牛膝聚为独立的一支，呈现较好的单系性，野生牛膝和柳叶牛膝均未单独聚为一支，种间差异较小，未能有效进行区分，见图3。

图3 基于MatK序列建立土牛膝与其混伪品的NJ树图

5 讨论

土牛膝作为西南地区瑶族和土家族常用的民族药，应用十分广泛。基于现有样品的ITS 序列变异分析表明，粗毛牛膝、柳叶牛膝暂未在现有样品中发现种内变异，后续需进一步扩大样品量；野生牛膝种内变异较小，种内最大K2P 为0.006。土牛膝药材及其混伪品ITS 扩增序列NJ 树图分析表明，粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝可相互区分，土牛膝3 种基原与其混伪品川牛膝、广东土牛膝区别明显；MatK 扩增序列NJ 树图分析表明，粗毛牛膝单独聚为一支，但与野生牛膝和柳叶牛膝未能进行有效区分。因此，ITS 作为常用的DNA 条形码，不仅可以鉴定土牛膝3 种基原，而且可以有效区分其常见混伪品川牛膝和广东土牛膝。