犬瘟热诊断技术的研究进展

程敏姮，张启龙，潘珺，李蕊，高敏，苗燕，郑博君，张玮，傅彩霞

(北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629)

犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)属副黏病毒科，并与麻疹病毒和牛瘟病毒同属麻疹病毒属，亲缘关系较近[1]。CDV为不分节、非重叠、有囊膜的单股负链RNA病毒[2]，基因组约包含约15 690个核苷酸并主要编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白基质(L)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)[3-4]。该病毒是一种泛嗜性病毒，可侵害呼吸系统、血液系统、消化系统、免疫系统，甚至是神经系统，从而引起机体全身性病理变化，造成大批发病死亡，死亡率在30%～80%之间。CDV宿主广泛，包括犬科等所有食肉目科以及偶蹄目猪科、鳍足目海豹科、猫科，近几年大熊猫、老虎、灵长目猕猴科都相继出现犬瘟热病例[5-7]。随着环境的变化，CDV对动物的适应性逐渐增强，免疫动物的发病率和死亡率也在升高，即使在美国、日本等大范围定期接种疫苗的地区也可能暴发[8]。迄今为止，对于该病的防治措施除定期接种疫苗外，尚无特异有效的治疗方法。因此，确定一种敏感性高、特异性好、快速简便且适用于基层快检或实验室高通量检测的诊断方法尤为重要。

1 临床诊断

犬瘟热主要有两种临床表现，分别为急性型和慢性型[4]。其中急性型病例呈现双相热，出现皮疹、呼吸困难、咳嗽、打喷嚏、厌食、结膜炎及黏液或脓性眼鼻分泌物等临床症状。随着病程发展，常伴随有细菌或支原体二次感染，继而出现腹泻、血便、呕吐等症状，部分甚至出现神经症状，表现为抽搐、眼球震颤、共济失调、姿势反应障碍、瘫痪或麻痹，在病程晚期通常出现脱髓鞘性脑炎。慢性型的感染动物发病迟缓，免疫应答反应不强烈，同时伴有一些不明显的早期临床症状。有些毒株感染细胞能力低，不易形成包涵体，例如A75/17毒株可以入侵大脑某些区域而未引起炎症反应，且能够在中枢神经系统内长期存在。

临床诊断需要丰富的临床经验才能做出初步诊断，且仅靠临床症状并不能作为犬瘟热确诊的依据，还需配合其他方法进行确诊。

2 传统诊断技术

2.1 组织病理学检测

CDV经呼吸道上皮细胞感染机体后入侵淋巴组织、扁桃腺和支气管淋巴，继而造成肺、肾、脾脏、心脏、肝脏、胃肠黏膜等组织器官出现出血、肿大等现象。置于光学显微镜下观察，可见心、肾、肺淋巴细胞浸润，肺泡腔内有大量红细胞和坏死的肺泡上皮细胞，肾上皮细胞发生核固缩[9]。同时感染细胞中可见红色或暗红色、匀质、边界清晰的包涵体，一般为圆形或椭圆形，也有呈镰刀形而紧贴于胞核上的，存在于核内的包涵体。包涵体是CDV感染的重要标志之一[10]。置于电镜观察下，可见犬瘟病毒粒子呈现多形性，多数为球形，病毒粒子的直径为110～550 nm之间。核衣壳呈螺旋状，总长度为1 000 nm，螺旋直径15～19 nm，螺旋中心5 nm的孔，螺距5～6 nm。病毒有囊膜，其内部为M蛋白，后约5 nm，表面为H和F两个糖蛋白组成的纤突，长度为9 nm[11]。房红莹等[12]将免疫电镜技术与离子捕获电镜技术相结合，建立了改良版离子捕获电镜法，提高了完整CDV粒子的检测率，其效果要比单纯的离子捕获电镜法强。

组织病理学检测可以根据组织病变、病毒结构、典型包涵体等特征，更直观的鉴别病毒，但是该方法制备过程较为复杂繁琐，非专业人士无法操作，故一般不作为常规检查手段，仅限于研究应用。

2.2 病毒的分离培养

分离培养是研究病原体最直接的方式，目前常用于CDV病毒分离的细胞主要有两类，即原代细胞和传代细胞系。宋爽[13]验证了9种细胞对犬瘟热病毒的敏感性和操作性，试验表明对弱毒CDV敏感的细胞系(Vero等传代细胞系)对临床流行株不敏感，不能形成CPE，也不感染。John等[14]研究表明在细胞传代与接毒时添加胰酶，细胞可出现CPE。肺泡巨噬细胞(DLM)对临床流行株敏感且分毒效率较高，但是试验要求高，不适宜推广使用。而外周血淋巴细胞(PBL)容易获得，对临床流行株敏感度又高，操作也简单易行，适宜作为临床流行株分离的细胞。对现有细胞系的改造也大大提高CDV分离率，赵建军等[15]通过建立稳定表达CDV细胞受体SLAM的Vero细胞系实现了CDV快速分离。

CDV对外界环境的抵抗力较弱，其脂质囊膜结构较脆，易被光和热灭活，因此病毒分离成功率较低。此外CDV分离培养的工作量大，不适宜作为临床快速诊断的诊断方法。

2.3 免疫学检测

免疫学检测是临床上较为常用的方法，包括病毒中和试验、琼脂扩散试验、ELISA、免疫荧光等。病毒中和试验具有较高的特异性，既用于病毒株的种型鉴定，还用于血清中和抗体效价的测定，是国内外诊断CDV和临床上监测免疫效果的标准方法，但该方法操作繁琐、耗时长、工作量大。Woemle等人于1966年就将琼脂扩散试验进行标准化，1994年我国研究者任文陟等[16]建立了犬瘟热琼脂扩散试验方法，并与电镜结果相比较，其阳性符合率达85.7%，总体符合率为90%，该方法操作简便，但敏感性差。

ELISA在犬瘟热病毒感染的早期和持续感染中因快速、敏感、易于标准化等优点已广泛用于CDV的检测[17-19]。蔡孜萌等[20]以纯化的重组H蛋白作为包被抗原建立了CDV间接ELISA检测方法，该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，与商品化检测试剂盒的符合率达92.5%。Chan等[21]应用原核表达系统制备CDV 的H蛋白，将其作为检测抗原，用于检测犬血清中抗体，具有良好的稳定性和特异性。Labrini等[22]研究表明直接免疫荧光法具有高特异性和高敏感性，且与PCR检测结果有较好的一致性，而结膜细胞学检测效果差。但ELISA方法存在重复性差、易出现假阳性等不足，且干扰因素较多，如自身抗体、仪器、操作、温度等。

2.4 PCR检测

Shin等[23]对建立的RT-PCR和套式PCR进行了对比，结果表明套式PCR的敏感性高于普通的一步法RT-PCR。为了同时检测CDV和犬冠状病毒，Wang等[24]建立了一种快速简便、高特异性和敏感性的双重RT-PCR检测方法。采用优化的双重RT-PCR方法对北京、山西和安徽等地区进行检测，其检出率分别为12.35%、7.5%、13.63%。张洪亮等[25]根据H基因建立了可鉴别诊断疫苗株和野毒株的RT-PCR-RFLP方法，为临床上CDV的疫苗株和野毒株的鉴别诊断提供了依据。

与上述几种检测方法相比，普通RT-PCR具有更高的敏感性和特异性，但相比荧光定量PCR而言，普通PCR存在产物易污染、假阳性、不能定量检测等缺点。

2.5 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR以其敏感、快速等特点越来越多的应用在疫病诊断领域。Elia等[26]建立的CDV TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的特异性和敏感性，能够检测100 copies。由丛华等[27]根据CDV的M基因建立了SYBR Green荧光定量PCR，该方法特异性高、重复性良好，最低检出限为10 copies，并能有效鉴别犬瘟热的强弱毒株。赵雪丽等[28]根据CDV的H基因和CPV的VP2基因建立了犬瘟热和犬细小病毒双重实时荧光定量PCR，该方法灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点，其最低检出限为10 copies，两种病毒同时或单独存在，或浓度相差较大时均不影响对核酸的定量检测。王介淞等[29]根据CDV的核衣壳蛋白(NP)基因建立了TaqMan实时荧光定量PCR，该方法可以成功检出水貂外周血淋巴细胞中的CDV。近年来吉林、山东、上海等地相继颁布实施了以荧光定量PCR为诊断方法的地方标准[30-33]。

与普通PCR相比，实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高自动化、安全无污染等优点，可以通过计算机和分析软件实现PCR扩增、产物检测和定量分析一体化，同时杜绝了传统PCR开放检测对环境的污染和由此导致的假阳性。但是荧光定量PCR需要特殊的实验仪器，对于临床及基层的普适性较差。

3 快速诊断技术

3.1 试纸条诊断技术

犬瘟热胶体金试纸条是采用胶体金免疫层析技术研制而成，一般采用双抗体夹心方式，属于一步式固相膜反应。该方法具有快速、简便、廉价、可单份检测、稳定性好、特异性高、检测标本种类多等优点。目前也是宠物医院等临床用于CDV检测中使用最广泛的检测方法。但是该方法的灵敏度和特异性与RT-PCR相比较低，且不能定量检测34]，敏感性较低。陈峥嵘[35]根据179株Asia-Ⅰ型CDV的H基因和3株弱毒疫苗株H基因设计出AS-PCR上游特异性引物和下游通用引物，同时制作相应的AS-PCR核酸试纸条，该方法可以区分野毒株和疫苗株。但该方法可能存在地域限制的不足，其核酸试纸条也没达到最优预期效果。

3.2 重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)

RPA是一种新型的等温基因扩增技术，该技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由2个相对的引物起始一个合成事件。该反应在37 ℃左右，一般可在10～20 min获得可检出水平的扩增产物，反应灵敏、设备要求低，适合临床快速检测[36]。已在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面得到较好的应用[37-40]。Wang等[41]建立一套快速、简便、可靠的RT-RPA检测方法，该方法只需在40 ℃下进行，反应3～12 min即可观察到结果，既可用于实验室诊断也可用于宠物医院临床检测，尤其在条件有限的情况下也可完成检测。熊炜等[42]建立了一套实时荧光RPA检测方法，该方法在39 ℃恒温反应25 min即可判读结果，且具有良好的稳定性、可靠性、特异性和敏感性。

3.3 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一种新型基因扩增方法，其特征是针对靶基因上的6个区域设计4条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15～60 min内实现109～1 010倍扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。Cho等[43]根据CDV的N基因建立了RT-LAMP检测方法，该方法在65 ℃恒温下反应60 min即可完成，且可直接目视检测结果。与荧光定量PCR相比，检测时间短、操作简便、可目视观察结果。胡嘉欣等[44]建立的CDV RT-LAMP检测方法可检测到RNA的浓度为5.6×10-6ng/μL，试验过程比国标RT-PCR缩短了1.5 h。何丽丽等[45]根据CDV的N基因建立的RT-LAMP方法可检测到70 copies。郝镯等[46]建立了一种新型、稳定、可普遍应用的犬瘟热RT-LAMP-LFD检测方法，该方法是将环介导等温扩增技术与横向流动试纸条相结合，具有特异性强、敏感性高、操作简便等优点，最低检测限为100 copies。目前环介导等温扩增技术已在食品检测、结核病等领域有着广泛应用[47]，但在动物疫病领域应用的报道还较少，LAMP方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可，具有高效、快速、便捷的特点，更加适于在临床和野外监测站进行推广使用。但目前应用于犬瘟热的检测方法的最终结果判定依然是依靠浊度仪、荧光检测仪来观察判定，或是通过浊度目视判定。

3.4 基因芯片技术

基因芯片技术是通过把巨量的已知的寡核苷酸、肽核苷酸或cDNA固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成DNA/RNA微阵列，然后将样品基因组DNA/RNA进行体外扩增并渗入标记分子后，与位于微阵列上的已知DNA序列杂交，用激光共聚焦荧光检测系统或质谱法、化学发光法、光导纤维法等检测方法检测其信号强度。该技术主要分为两种，一种是可视化技术，即将检测信号通过各种方法扩大，以便达到可视化检测；另一种是通过提高基因芯片中目的基因载量，该技术在临床上对疫病高通量检疫有重要影响。汪琳等[48]利用快速、高效、高通量的基因芯片技术，建立了可同时检测犬传染性肝炎病毒、CDV和犬细小病毒的基因芯片筛查检测方法，该方法对CDV的检测灵敏度达100 copies，特异性、重复性较好，具有实际应用于口岸检测的价值。

基因芯片技术通过把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速的检测和分析。但存在技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围狭窄等不足。

3.5 新型基因测序技术(next generation sequencing technologies,NGS)

NGS是一系列在2004年后问世的新的DNA测序技术，这些新技术依靠高度并行的基因序列读取方式取得高通量DNA测序，在数天内即可完成第一代基因测序技术花费10年的人类基因组测序。NGS又分为第二代测序和第三代测序，第二代测序以Roche公司的454技术、ABI公司的SOLiD技术和IIIumina公司的Solexa技术为代表。其中454测序的DNA片段无需荧光标记，无需电泳，边合成边测序，碱基在加入到序列中时，会脱掉1个焦磷酸，通过检测焦磷酸识别碱基，因此也被称为焦磷酸测序。SOLiD以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，可对单copiesDNA片段进行大规模和高通量并行测序。Solexa同样为边合成边测序，该技术在测序的过程中，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。因为dNTP的羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基，此时，用激光扫描反应板表面，根据dNTP所带的荧光读取每条模板序列每1轮反应所聚合上去的核苷酸种类，经过“合成-清洗-拍照”的循环过程，最终得到目的片段的碱基排列顺序。

第三代测序以Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为代表，其技术原理是将含有1对电极的特殊脂质双分子层置于微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔，并且每个纳米孔会结合1个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA分子的序列。Peserico等[49]利用微型纳米孔(MinION)测序技术成功读取病死犬脑组织中的犬瘟热核酸序列，且与RT-PCR和免疫组化检测方法具有良好的一致性，该方法通量大、时间短、精确度高、信息量丰富，在临床诊断中具有非常好的潜在优势。

新一代基因测序技术相比RT-PCR、荧光定量PCR而言，具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优势，但是成本较高不适宜基层临床大范围的推广使用。

4 展望

诊断准确性高、诊断时间短、多样品同时诊断、诊断设备简易且成本低、基层人员即可操作一直是诊断方法的风向标。随着科学技术的发展，快速、简便且准确的诊断技术一直在不断优化，如纳米金、核酸适体、CRISPR/Cas技术、微流控芯片、可视化芯片技术、LAMP芯片技术、新型高通量筛查技术、宏基因组学等方法均不断应用于动物疫病防控、诊断、治疗[50-52]，但在犬瘟热检测方面的报道研究还很少。对此，我们有以下三点思考：是否可以利用纳米金复合物为肉眼可见的红色斑点这一特性，采用免疫层析技术，制备快速检测犬瘟热的纳米金试纸条；CRISPR/Cas技术是一种高效简便、能精准定位并进行基因编辑的技术，是由一种适应性免疫防御机制基础上发展的新技术，能否利用CRISPR的基因编辑系统，开发用于大熊猫等珍稀动物的犬瘟热的临床诊断及治疗；能否基于宏基因组学方法建立我市犬瘟热基因信息文库，以便高效、快捷地全面分析我市生态环境中犬瘟热病毒分布情况，实时掌握我市犬瘟热病毒流行趋势及防控效果，为疫苗的选择提供更加准确的数据资料。

快速检测技术因其低成本、简便、快速等特点更适合快速筛查和现场检测，更受宠物医院、动物园以及疫病检测部门青睐，是基层有效防治犬瘟热的技术支撑。但我们认为目前的多种快速诊断方法还应在以下三个方面进行改良：一是国内做快速诊断技术应在确保特异性的前提下进一步提高检出限(limit of detection，LOD)，提高检测方法的灵敏度；二是建议将恒温快速检测技术与目视荧光试剂结合，在保证不影响扩增反应的前提下，建立更简便、更直观、更客观的结果判定方法；三是应将纳米金、核酸适体、CRISPR/Cas技术、微流控芯片、可视化芯片技术、新型高通量筛查技术、宏基因组学等方法应用于犬瘟热的检测研究中，综合多方面技术的优势，切实建立敏感性高、特异性好、快速简便且适用于基层快检或实验室高通量检测的诊断方法。