缺血再灌注损伤下微囊泡抑制心肌细胞凋亡的研究进展

常冀杨 孟晓菲 周佳奇 黄开越 张清潭

1滨州医学院附属医院老年医学科，山东 256600；2滨州医学院附属医院骨关节与运动医学科，山东 256600

随着人口老龄化，心肌组织的缺血再灌注损伤（如心肌梗死、心力衰竭）已被公认为是导致死亡的重要原因之一。据世界卫生组织统计，到2020年，缺血性心脏病将成为最常见的致死性疾病之一［1］。恢复血液再灌注可有效减少缺血性心脏损害，但值得注意的是，心肌组织的血液供应恢复后常发生心肌再灌注损伤，并可能引起不可逆的损害［2］。目前已知的缺血再灌注损伤的可能机制包括氧化应激、炎症、内皮细胞功能障碍等［3-4］，并最终导致细胞死亡。凋亡作为细胞程序性死亡方式之一，目前被认为是细胞缺血再灌注损伤中最为重要的分子机制。而凋亡的发生同样依赖于许多病理生理过程，如炎症、氧自由基的增加、线粒体损伤等。研究者们过去常常关注上述病理机制，希望从中寻求新的治疗思路。然而近十年来，最新研究发现微囊泡同样也参与了缺血再灌注所诱导的细胞凋亡，并且在其中发挥重要作用。

研究发现，当细胞受到外界刺激或发生凋亡时，微囊泡将从不同类型的细胞质膜中释放出来。同时，微囊泡可以传递信号，并作为介导细胞通讯的系统信使诱发一系列细胞形态和（或）功能改变［5］，从而导致细胞凋亡。当然，细胞的凋亡不完全基于缺血再灌注损伤的直接刺激，受刺激的细胞可以通过释放微囊泡间接作用于正常的外周细胞，从而进一步促进周围其他的细胞凋亡［6］。换言之，在微囊泡的参与下，可放大细胞凋亡。然而令人惊讶的是，在某些特定条件下，微囊泡的增多可抑制缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡，从而发挥其保护作用［7］，且这一作用越来越受到关注。本篇综述中，我们概括了微囊泡在细胞缺血再灌注损伤中的形成及特征，进一步总结了微囊泡抑制心肌细胞凋亡的可能分子机制，并初步归纳了微囊泡在缺血再灌注相关的心脏疾病中的作用，为缺血性心脏病的治疗提供了新思路。

1 微囊泡与缺血再灌注损伤

1.1 微囊泡 微囊泡是一类直径在100～1 000 nm的球形结构分子［8］，通过质膜出芽释放出的可以表达原始细胞特有的抗原磷脂囊泡。尽管先前研究将微囊泡作为惰性碎片，认为其形成代表着一种生理现象，但是越来越多的试验证据表明，多种病理过程与微囊泡的显著增加有关。微囊泡可被各种类型的细胞所释放，并且根据所释放细胞来源和状态而在成分上有所不同。例如，在细胞损伤、炎症、血栓形成和血小板活化期间，外周血中循环的微囊泡数量会显著增加［9］。目前研究表明，微囊泡通常在外界刺激下形成于质膜内富含脂质的微区中［10］，如细胞内钙超载可以触发微囊泡的形成，随后磷脂进行不对称重排［11-12］，膜破裂后可激活钙敏感酶，从而促使膜蛋白脱离细胞骨架结构，最后形成微囊泡［13］。其中，凋亡型微囊泡的形成关键取决于Rho相关激酶ROCK I，其在凋亡过程中通过半胱天冬酶介导的裂解而被激活［9］。ROCK I可以激活肌球蛋白轻链的磷酸化和肌动蛋白-肌球蛋白丝与质膜的偶联，从而诱导细胞骨架重排至微囊泡的形成。尽管我们尚未完全准确了解微囊泡形成的确切机制及各种细胞群体之间所释放的微囊泡类型不同的原因，但由此可以推测，细胞骨架重组或代表了微囊泡的形成关键步骤。随着越来越多相关试验的进展，我们已经发现微囊泡能够携带大量的蛋白质、脂质及各种核酸（例如RNA和DNA），使微囊泡可以通过将具有生物活性的分子转移到周围细胞来介导细胞间的“交流”。正由于微囊泡参与了不同的生物学过程，由微囊泡介导的细胞凋亡在各种疾病的发生和发展中起着重要作用，包括细胞间通讯、信号转导和免疫调节。例如，张磊［14］证实了从人类胚胎神经干细胞释放的微囊泡通过介导高表达的热休克蛋白70有效抑制了心肌细胞凋亡。此外，经该类微囊泡干预后可增加内皮细胞间连接蛋白的表达，从而减少内皮细胞凋亡并诱导增殖［15］。除了携带蛋白质之外，由于微囊泡富含诸如鞘磷脂、磷脂等脂质，因此微囊泡具有比原始细胞更稳定的结构。存在于微囊泡表面的溶血性磷脂酰胆碱（LPC）与循环免疫球蛋白M耦联，进而与凋亡细胞结合，使微囊泡与凋亡细胞一起被清除［16］。迄今为止，对微囊泡所释放的不同类型的RNA的研究较为广泛。其中，对微小RNA（miRNA）的研究最多。一项大鼠模型的研究表明，微囊泡能够将遗传物质、转录因子传递至受体细胞并转化其表型［17］。在肿瘤细胞系中，微囊泡治疗降低了癌细胞生存能力、增加了癌细胞的凋亡水平，并降低了B细胞淋巴瘤2蛋白的表达及线粒体膜电位［18］。Rhodes等［19］研究表明，微囊泡中携带miRNA含量可能因疾病而异。一方面，他们发现与患有稳定性冠心病患者相比，微囊泡增强了急性冠脉综合征患者中促炎性miRNA（miR-19、miR-21、miR-146、miR-155和miR-223）的表达水平。另一方面，源自内皮前体干细胞的微囊泡可以促进内皮细胞修复，以上过程正是由于微囊泡携带促血管生成的miRNA引起的［20-21］。综上所述，正是由于既能够参与细胞之间的通讯以维持生理平衡，又能协助介导传递体内诱导疾病的信号，我们可以将微囊泡看作是成为未来各类疾病的潜在治疗手段。

1.2 微囊泡与心肌细胞缺血再灌注损伤 心肌细胞的缺血再灌注是许多心血管疾病的病理生理基础，如心肌梗死和心力衰竭。细胞凋亡是缺血再灌注后心肌细胞死亡的主要机制之一。在缺血再灌注损伤下，微囊泡在缺血再灌注损伤过程中数量增加，可能导致内皮功能障碍、白细胞黏附、血小板活化等现象。已有多项试验证明了经微囊泡处理干预后会显著加重心肌细胞缺血再灌注损伤［22］及血管内皮功能障碍［23］。值得注意的是，微囊泡作为一把“双刃剑”，在缺血再灌注损伤中的所发挥的作用不尽相同，不仅取决于其释放细胞的微环境，而且还取决不同的细胞来源［24］。Wang等［7］研究发现由缺血条件下心肌细胞释放的微囊泡显著减少了心肌梗死的面积和凋亡心肌细胞的数量，从而验证了微囊泡的保护作用。此外，有研究表明miR-22携带的间充质干细胞释放的微囊泡可保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤［25］。而人类胚胎神经干细胞可以释放携带热激蛋白70的微囊泡，这类微囊泡的释放也可以起到抑制心肌细胞凋亡的作用［14］。由于释放细胞的微环境、携带物质的种类和来源细胞的差异，微囊泡的功能均有所不同。在缺血再灌注损伤中，微囊泡不仅显示出促进细胞凋亡的作用，更显示出保护性心肌细胞的作用。因此，在缺血后再灌注期间携带大量“信号货物”而被释放出的微囊泡与心肌细胞凋亡密切相关。

2 微囊泡抑制缺血再灌注条件下心肌细胞凋亡的机制

大量研究表明，在缺血再灌注损伤体内、外模型中，微囊泡均可通过不同的机制抑制凋亡从而发挥保护作用［26］，而这一发现有望使微囊泡在缺血性心脏疾病的治疗上成为一种新型治疗方法。在此，我们总结了微囊泡抑制缺血再灌注条件下心肌细胞凋亡的可能机制。

2.1 内质网应激途径 内质网作为不同蛋白质和脂质的生物合成场所，为细胞稳态维持和凋亡提供了主要区域［27］。在细胞应激条件下，包括缺血再灌注损伤、缺氧等，都可能导致内质网功能障碍，也就是众所周知的内质网应激［28-29］。越来越多的证据表明，当细胞受到刺激时，未折叠蛋白质反应可以在缺血再灌注损伤的心肌细胞中被激活应答内质网应激条件［30］。GRP78作为主要的内质网的分子伴侣，是未折叠蛋白质反应的主要调节剂，心肌细胞中GRP78经缺血再灌注诱导可激活心肌细胞中Akt信号通路，从而保护细胞免受缺血再灌注损害［31］。在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，来自缺血预处理后释放的微囊泡被证实通过抑制内质网应激对在缺血再灌注条件下的心肌细胞凋亡存在抑制作用。经缺血预处理后，研究人员检测到心肌细胞中半胱天冬酶3、9、12的活性也显著下降，而且TUNEL染色显示阳性细胞核的百分比和数量均降低。通过蛋白质印迹分析证实，在经缺血预处理后释放的微囊泡能够使GRP78的表达明显上调［32］。还有其他研究也阐述了微囊泡可以降低细胞凋亡程度，然后通过内质网途径控制了GRP78的表达，从而保护心肌细胞的结构和功能。另外，血小板所释放的微囊泡也被证实参与了大鼠后肢经缺血再灌注预处理的心脏保护作用，经预处理后的血小板、内皮细胞、红细胞、大鼠后肢细胞释放出的微囊泡均能够通过抑制内质网应激减少细胞的凋亡［33］。此外，研究表明，在缺血再灌注损伤期间，缺血的心肌细胞释放的微囊泡可显著减少心肌梗死的面积，并通过内质网应激途径减少心肌细胞的凋亡。与试验组相比，缺血再灌注后心肌细胞所释放微囊泡治疗组的肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）活性明显降低。同时，半胱天冬酶12作为一种在内质网应激表达的公认的标志物，在心肌中的表达也同样显著降低［7］。维持钙稳态对于线粒体和内质网的正常功能也同样至关重要。众所周知，心肌缺血再灌注损伤可引起细胞内钙超载，进一步致心肌损伤甚至细胞凋亡。大量研究发现，调节心肌细胞中钙的浓度主要取决于网状Ca2+-ATP酶（SERCA2），此外，p-PLB是SERC2的调节蛋白的磷酸化形式。SERCA2与细胞中钙浓度的调节紧密相关，它可将钙从细胞的胞质中转运至内质网中。有试验表明，在凋亡过程中正常心肌功能受损并伴有SERCA2表达降低时，更多的钙离子会滞留在胞质中［34］。研究表明，在经微囊泡治疗后，GRP78、SERCA2和p-PLB的表达显著增加［7］。综上所述，心肌细胞释放的微囊泡通过内质网途径介导钙稳态来发挥保护作用，从而抑制缺血再灌注损伤中的心肌细胞凋亡。

2.2 miRNA易位途径 过去被视为细胞碎片的miRNA，随着近些年来研究的深入，科学家们发现其参与了各种生理和病理过程，目前在科研界受到极大的关注。有研究表明从内皮干细胞释放的微囊泡可以携带miRNA从而抑制细胞凋亡。例如，通过转运保护性miRNA，如miR-126和miR-296，微囊泡降低了细胞受缺氧（缺血）的影响，从而保护细胞免受缺血再灌注损伤［20］。众所周知，急性心肌缺血/再灌注导致心肌细胞凋亡，并进一步导致左心室重构和进行性心力衰竭。多能干细胞（iPS细胞）起源于重新分化的体细胞，目前正作为基于干细胞疗法的一种极有发展前景的手段受到人们的广泛关注。Wang等［7］研究证明，可以在心肌细胞中明显观察到多能干细胞释放的微囊泡抑制缺血再灌注损伤诱导的氧化应激，从而保护心肌细胞免于凋亡。此外，分别由Nanog和低氧诱导因子-1（HIF-1）调节的心脏保护性miR-21和miR-210在多能干细胞释放的微囊泡中高度富集，并能够被有效传递至心肌细胞。这些发现表明，微囊泡通过抑制缺血性心肌细胞中半胱天冬酶3、7的活化而显著减少了心肌细胞的损伤，这在一定程度上是携带特定的miRNA（例如miR-21和miR-210）的保护结果［35］。Yu等［25］研究结论也支持类似的结果，他们发现由微囊泡转运的miR-221/222在间充质干细胞中的表达增高，可相对保护更多细胞免于凋亡。综上所述，以上结论证明了心肌细胞免受缺血再灌注损伤的保护作用是由miR-221介导的，而该保护序列部分由间充质干细胞衍生的微囊泡所转运。

3 缺血再灌注相关心脏病中的微囊泡

包括急性冠脉综合征和心力衰竭在内的缺血性心脏病仍是全世界死亡和致残的主要原因之一［36］。研究表明，对缺血性心脏病最有效的治疗方法之一是及时进行再灌注治疗。但是，再灌注会导致进一步的心肌细胞损伤，通常被称为是心肌缺血再灌注损伤。本综述阐述了微囊泡在缺血再灌注损伤后释放并触发各种不同的细胞信号传导途径，从而影响细胞的凋亡。基于以上分子层面的研究，已有研究者将此应用于缺血再灌注体外模型，并发现微囊泡可发挥一定的保护作用。例如，Giricz Z等证实缺血再灌注损伤大鼠中经缺血预处理心肌细胞产生的微囊泡治疗后可以减少心肌梗死的面积。另外一项临床试验中，Zhou等［37］还证实了在接受经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后的ST段抬高型心肌梗死患者中，来自各种细胞来源的微囊泡水平与变化的时程不尽相同。试验结果显示，PCI后微囊泡的水平显著增加，并且在48 h达峰值，这表明微囊泡的增多可能在PCI术后患者的心脏中也发挥保护性的作用。此外，微囊泡的治疗还可以用于检测药物的临床疗效。例如，血管内皮细胞释放的微囊泡水平的升高可反映血管内皮损伤，研究提示与应用10 mg阿托伐他汀相比，40 mg阿托伐他汀可以降低缺血性心脏病患者循环内血管内皮细胞释放微囊泡的水平，这表明循环中微囊泡的显著下降与内皮功能的改善密切相关。同时，有研究指出，当血管内皮细胞处于促凋亡状态时，可能会破碎成微囊泡，故血管内皮细胞水平的降低可能是由于其微囊泡脱落所致，也增加了除传统危险因素外的主动脉的硬化程度［38］。因此受损的血管内皮细胞生成和其释放的微囊泡生产可能是导致缺血性损伤加重的机制。近年来的研究和临床试验已经初步证实了微囊泡在缺血再灌注相关疾病中的重要作用，而这也为微囊泡作为靶向治疗缺血性心脏病的新策略提供理论基础。

4 小 结

本篇综述主要概括了微囊泡在细胞缺血再灌注损伤中的形成及特征，并进一步总结了微囊泡抑制心肌细胞凋亡的可能分子机制，并初步归纳了微囊泡在缺血再灌注相关的心脏疾病中的作用。研究发现在缺血性疾病中，源自不同来源的微囊泡的释放在疾病的发病机制中起着重要的作用。随着缺血性心脏病成为人类目前主要的死亡原因之一，我们迫切需要针对缺血性心脏病患者的新型治疗策略。微囊泡之所以引起了人们极大的兴趣，正因为它们作为各种疾病的信号或生物标志物，具备能够将多种蛋白质或遗传物质递送至心肌细胞发挥保护作用的潜在治疗价值。微囊泡已被证实参与心肌细胞缺血性损伤的调节，并且还保护心肌细胞免于凋亡。尽管近年来已经有不少学者在研究微囊泡形成的机制，但微囊泡如何精确靶向特定组织仍有待商榷。虽然越来越多的证据展示了基于微囊泡的治疗可以受到巨大获益，但目前仍缺乏针对缺血性心脏病中微囊泡的实用价值研究。因此，作为缺血性心脏疾病治疗可能的新方向，更多关注的重点在于进行各种临床试验以评估微囊泡作为缺血性心脏病的潜在治疗方法的可行性。