高分辨质谱法快速筛查生鲜乳中的雌激素类药物

贡松松，陆亚男，王 博，张 婧，吴剑平，严 凤，曹 莹

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

近年来，食品安全问题日益受到人们的关注。从苏丹红鸭蛋、三聚氰胺奶粉到瘦肉精“健美猪”事件，无一不牵动着全国百姓的神经。而重要原因就是滥用或非法使用兽药或饲料添加剂，非法添加禁用物质。欧盟出台了相关法规，严格规定兽药残留限量，我国在这方面，也出台了相关规定。雌激素残留已成为引起儿童性早熟及相关癌症等多发的潜在危害[1-3]。

雌激素目前检测方法主要有气相色谱质谱联用法[4]和高效液相质谱联用法[5]。气相色谱质谱法仍有缺陷，需要衍生化步骤，过程较为繁琐。但高分辨质谱（本文以四级杆高分辨为例）通过既可以获得精确分子量信息又能获得二级及多级特征碎片离子信息，使其在多残留分析领域优势明显[6,7]。本研究在传统方法基础上，改良QuEChERS[8-11]方法，建立一种快速筛查生鲜乳中7种雌激素的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲酸（色谱级）美国天地公司；乙腈（色谱级）美国默克公司；乙酸（分析级）上海凌峰化学试剂公司；无水硫酸钠、氯化钠（分析级）国药集团化学试剂公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（ODS C18）（美国安捷伦公司）；实验用水为超纯水。

己烷雌酚标准品（Hexestrol,HES）、雌酮标准品（Estrone,E1）、雌二醇标准品（Estradiol,E2）、炔雌醇标准品（Ethinylestradiol,EE2）、己烯雌酚标准品（Diethylstilbestrol,DES）、雌三醇标准品(Estriol,E3)、双烯雌酚标准品（Dienestrol,DIE），纯度均大于96.1%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。7种雌激素标准品见表1。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱—四级杆飞行时间质谱（6530，美国安捷伦公司）；MassHunter数据处理系统（美国安捷伦公司）；Allegra X-22R高速冷冻离心机（德国贝克曼公司）；多管漩涡振荡器（北京踏锦公司）；Milli-Q超纯水系统（美国密理博公司）；AE240电子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 标准溶液的配制

标准品贮备液：分别称取标准品各10 mg，置于7个10 ml的棕色容量瓶中，然后用甲醇溶液溶解并定容到10 ml，制备得到的单标贮备液浓度为1mg/ml。为制备标准曲线和质量控制样品，使用时再根据需要混合或稀释制成混合标准溶液。将所有的标准品贮备液置于4 ℃冰箱低温避光保存。

1.4 样品前处理

称取5.0 g生鲜乳样品，置于50 ml离心管中，加入20 ml 乙腈，涡旋振荡1 min，称取1.0 g氯化钠和4.0 g无水硫酸钠，涡旋震荡4 min，9 000 r/min离心5 min。准确移取10 ml上层清液于离心管中，加入1.0 g无水硫酸钠，0.2 g PSA，涡旋振荡器振荡 4 min，9 000 r/min离心5 min，取5 ml上层清液于40 ℃氮气吹至近干，用1.0 ml乙腈-水溶液（5∶95，V/V）定容，涡旋30 s，过0.22 μm滤膜后，供超高效液相色谱—四级杆飞行时间质谱测定。

表1 7种雌激素类药物的名称、分子式、CAS号、保留时间、理论分子量、实测分子量、质量误差以及质谱碎片离子信息

1.5 超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱条件

1.5.1 超高效液相色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；流动相A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0 min，5% B；2 min，5% B，2～4 min，5%～40% B；4～7 min，40%～80% B；7～7.5 min，80%～9 5% B；7.5～1 2 min，95%～95%B；12～13 min，95%～5%B；13～15 min，5%B；柱温：35 ℃；流速：0.3 ml/min；进样量：10 μl。

1.5.2 质谱条件 干燥气流速：8 L/min；干燥气温度：320 ℃；阴离子模式；扫描范围：50～1 000 m/z；雾化器压力：35 psig；鞘气流速：12 L/min；鞘气温度：400 ℃；毛细管电压：3 000 V；喷嘴电压：500 V；飞行时间管真空度：2.04×10-7；碎裂电压：130 V；仪器在高分辨率（4 GHz），低质量范围（＜m/z 1 700）下操作。7种雌激素类药物的质谱分析参数和提取离子色谱图分别见表1、图1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择 为考察不同色谱柱的影响，本研究选取了SB C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）、SB C18（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）和Extend C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）3种色谱柱。研究发现，第一种色谱柱SBC18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）分离效果最好，因为越小的内径，峰形相对越对称尖锐。柱长会影响保留时间，虽然5 cm比10 cm保留时间更短，但是有些药物峰形较差。因此，如图1所示，选用内径更小的10 cm色谱柱，分离度更好，更有利于后续分析。

图1 7种雌激素类药物的提取离子色谱图

2.1.2 流动相的优化 为考察不同药物分离效果的影响因素，本研究选取水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液分别考察。实验发现，当加入甲酸或者乙酸时，药物峰形不对称，分离度较差。当不加酸仅用超纯水时，峰形较好。最终流动相选择乙腈和水，结合梯度洗脱方式，7种药物分离度较好。

2.1.3 梯度洗脱条件的优化 因为目标药物的极性差异较大，采用梯度洗脱是最佳选择。本研究通过改变有机相在初始流动相中的比例（5%、10%、20%）和不同洗脱时间（12 min、15 min、20 min）对洗脱效果进行研究。研究发现，当乙腈的初始比例为5%时种雌激素类药物能缓慢洗脱下来，结合避免色谱柱上的药物残留和冲洗时间，最终选择5%乙腈作为初始流动相，洗脱时间15 min。

2.1.4 定溶液的优化 实验中发现，样品进样前的定溶液对目标药物的分离效果和离子化效率具有很大影响。因此比较了超纯水、乙腈一水（5∶95，V/V）、乙腈一水（20∶80，V/V）、乙腈一水（5 0 ∶5 0，V/V）和乙腈一水（90∶10，V/V）作为不同定溶液的影响，研究发现，当初始流动相中有机相的比例不小于定溶液时，峰形较好且对称。当初始流动相中有机相的比例小于定溶液时，目标药物峰形变宽，分离效果较差。因此，最终实验选择乙腈一水（5∶95，V/V）作为定溶液。

2.2 质谱条件的优化

阴离子模式下，通过一级质谱全扫描可以获得目标药物的总离子色谱图。逐个选择各个药物的提取离子色谱图，依据响应和峰形，依次对喷嘴电压等相关参数进行优化。最后对碎裂电压进行优化，得到最优的相关参数。最后参数见1.5.2。

表2 7种目标药物的基质效应、线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.3 样品前处理方法的选择

2.3.1 QuEChERS提取步骤的优化 所有的目标药物为了都能提取到，提取溶液选择了不同酸度的乙腈进行研究，具体为：乙腈、0.1%的甲酸乙腈、1%的甲酸乙腈、0.1%的乙酸乙腈、1%的乙酸乙腈。研究表明，最后4组的两种药物回收率太低，双烯雌酚和己烷雌酚小于30%，且可能出现假阴性，己烯雌酚无法检出，第一组药物回收率总体满意，所有药物介于60%和120%之间，因此，最终选择乙腈作为QuEChERS提取溶剂。

2.3.2 QuEChERS净化步骤的优化 为了去除农残，针对果蔬中脂肪酸色素等物质，传统的QuEChERS方法选择PSA作为吸附剂，但生鲜乳本身更加复杂，如不加去除，大量的脂肪和蛋白质会对实验造成干扰。PSA和C18都可用于去除这些干扰成分，但是在净化的同时，目标药物有可能被吸附，所以要对二者进行必要的优化。如图2所示，研究发现，分析所有药物的回收率，C18组两种药物低于50%，与之相比，选择PSA用于净化，所有药物回收率介于60%～120%之间，故最终选择PSA用于QuEChERS净化。

图2 优化实验条件的回收率实验

2.4 方法学验证

表3 7种目标药物的加标回收率及相对标准偏差（n=6）

2.4.1 标准曲线与线性范围 由于生鲜乳基质的复杂性，因此要对基质效应进行考察。分别选择空白生鲜乳样品基质溶液和初始流动相配制标准溶液，制作标准曲线。基质效应ME=k1/k2×100%计算。其中k1、k2分别是两套标准曲线的斜率。实验发现，雌三醇基质增强效应明显，3种药物基质抑制效应明显。本研究最终使用基质匹配标准曲线外标法用于定量。

2.4.2 检出限（LOD）与定量限（LOQ）对标准曲线的最低浓度用空白样品基质提取液逐级稀释，各药物的定性检出限，以3倍信噪比（S/N=3）计算，以10倍仪器检测信噪比（S/N=10）计算定量限，实验发现，目标药物LOD为5～20 μg/kg，LOQ为10～50 μg/kg。相关数据见表2。

2.4.3 回收率与精密度 将低、中、高3个浓度的标准溶液分别添加在空白生鲜乳样品中，平行测定6次，统计相对标准偏差及计算平均回收率。结果表明，目标药物的回收率为 63.5%～ 115.6%，相对标准偏差为3.4%～11.4%。相关数据见表3。

2.5 实际样品的筛查

利用已建立的方法初次对来自全国的80份生鲜乳样品进行筛查，对可疑数据结合二级特征碎片离子比对，检出了不同含量的雌三醇、雌酮。

进一步分析发现，作为天然激素，雌三醇、雌酮本身就是奶牛体内的内源性激素。

3 结论

本研究建立了一种高分辨质谱快速筛查与确证生鲜乳中雌激素类药物的方法。改进了前后处理方法，快速简便，准确性高，可作为该类药物的筛查方法。