黑蜂王台病毒基因检测及其病害诊断防治方法

魏菁 肖芳 宋战昀│文

1 黑龙江哈尔滨海关技术中心，150028；2 吉林长春海关技术中心，130062

蜜蜂病毒是威胁蜜蜂健康的最主要因素之一，通过对当前蜜蜂患病调查，有超过25种病毒会对蜜蜂造成威胁，并进一步感染到其他蜜蜂。其中，黑蜂王台病毒是造成蜜蜂患病数量较多的病毒。黑蜂王台病毒专门感染王台内幼虫，当幼虫发病后，王台会逐渐变黑，在蛹期死亡，形成一种与囊状幼虫病十分相似的坚硬的囊。当前黑蜂王台病毒只在西方蜜蜂中发现，我国尚未见类似相关报道，但针对黑蜂王台病毒的预防研究是十分必要的[1]。

一、黑蜂王台病毒基因检测

1.基于核酸序列的黑蜂王台病毒定性

在蜜蜂体内含有一组由基因编码构成的唯一性核酸序列，根据这一序列的特异性，将其作为鉴定蜜蜂是否携带黑蜂王台病毒的重要指标，以此对黑蜂王台病毒进行定性操作[2]。本文采用化学方法，通过人工合成的方式，将采集到的一小段蜜蜂病毒基因互补引物序列进行合成，并通过定量逆转录的方式实施扩增处理，并对黑蜂王台病毒样本中的基因结构进行定性检测。首先，在进行黑蜂王台病毒基因编码特异性诊断过程中，通过采用定量逆转录的方式，结合核酸复制所需的特殊环境，按照相应的比例加入到定量逆转录反应所需的试剂当中，充分搅拌后得到相应的混合溶液。加之核糖核酸中DNA聚合酶作用，将黑蜂王台病毒的核糖核酸分子作为模板进行逆转录，以此合成互补的脱氧核糖核酸。

其次，在脱氧核糖核酸当中找出另外一条链，通过脱氧核苷酸引物，完成对DNA中聚合酶的形成。在后续的每个循环当中，逐步提高倍数，并通过PCR完成循环操作。此时，原始的核糖核酸模板逐渐被核糖核酸酶降解，只保留剩余的互补DNA。

最后，在定量逆转录反应完成后，将得到的产物置于琼脂糖凝胶中，沿相反电极方向移动，分离得到纯化的酶链式反应产物。在紫外线光的照射下，利用显微镜对其进行观察，并将其与未感染黑蜂王台病毒蜜蜂的DNA梯形条带进行比对，从而确定黑蜂王台病毒基因的长度。

对特异性目的基因片段进行回收，将其用于后续质粒的克隆以及小量制备，以此获取到足够数量的目的DNA片段，用于对黑蜂王台病毒基因测序。将测序得到的核算数据输入到相应的数据库当中，完成对核算序列的比对，以此完成对黑蜂王台病毒种类的鉴定。由于定量逆转录反应的每个循环均能够使提取样本中的病毒拷贝数量呈指数级放大，并有更高的灵敏度，从而保证对黑蜂王台病毒基因检测分辨率提升。

2.qRT-PCR定量检测

根据黑蜂王台病毒核酸序列特异性特征，通过合成定量逆转录反应所需的引物以及特异性探针，对黑蜂王台病毒基因进行qRT-PCR定量检测。首先按照优化体系，将其引入需要进行充分反应的实际和特异性引物当中，再加入到黑蜂王台病毒样本检测，并使用qRT-PCR仪器进行定量。在选择一一对应的检测样本时，使用特异性探针，对其进行同步扩增反应，将初始病毒含量较高的样本剔除，保证其各个样本之间的加样量在同一范围以内[3]。通过qRT-PCR仪器对样本进行扩增，得到拷贝量呈2倍速度增加的病毒，并在这一过程中通过qRTPCR仪器检测信号功能，观察病毒起始时的浓度值，以及达到最高峰时的检测峰值。图1为基于核酸序列的黑蜂王台病毒定性结果。

图1 黑蜂王台病毒qRT-PCR定量检测结果

3.蜜蜂特殊组织病毒感染程度分析

通过本文使用能与蜜蜂黑蜂王台病毒基因序列互补的核算片段作为基因检测探针，本文结合原位杂交技术可以更加清楚地通过显微镜观测到蜜蜂在感染黑蜂王台病毒后其组织中的病毒情况，对蜜蜂特殊组织病毒感染程度进行分析。使用石蜡材料将感染黑蜂王台病毒的蜜蜂组织器官包裹，并制成显微镜观测用的玻片，并将其固定在显微镜的载玻片上[4]。再利用事先准备的核算探针，将其与玻片上的样本进行反应，将发生反应的复合物用荧光法进行染色。根据其荧光程度，对蜜蜂特殊组织病毒感染程度进行推断。当荧光数值在0～500dB范围以内时，说明蜜蜂特殊组织病毒感染程度较低；当荧光数值在500～1500dB时，说明蜜蜂特殊组织病毒感染程度中等；当荧光数值在1500～2500dB时，说明蜜蜂特殊组织病毒感染程度较高。

二、病害诊断防治方法研究

1.病害诊断

黑蜂王台病毒的直径通常在25～35nm之间，整体结构呈现为无囊膜正二十面体颗粒状，通常情况下，利用简单的观测设备很难进行观测。因此，对于黑蜂王台病毒的诊断，通常是基于蜜蜂患病症状、流行病学作为初步判断依据，再通过显微镜观察，得出黑蜂王台病毒的具体病源特征。表1为黑蜂王台病毒病原特征。

由表1可以看出，黑蜂王台病毒主要危害蜂王的幼虫和蛹，夏季和秋季为发病高峰期，其典型病状为患病幼虫无法及时脱皮并化蛹，蜕皮液逐渐累积在旧表皮当中，使得表皮逐渐变硬，并形成囊袋状结构。在这一过程中，幼虫的体色会逐渐由乳白色转变为浅黄色并进一步加深，直到变成黑色，并干枯。通常情况下，黑蜂王台病毒为无病症隐性感染方式长期存在于被感染的幼虫当中。除此之外，当蜜蜂感染黑蜂王台病毒后，神经系统会逐渐受到损伤，迷失方向，记忆功能与学习能力也会逐渐退化。具体表现为采蜜能力下降或丧失，全身抽搐，无法正常飞行。黑蜂王台病毒的主要传播方式为通过蜜蜂口器互饲的行为传播，当黑蜂王台病毒与其他病毒共同存在时，会产生联合危害，并表现出极强的致病能力。

表1 黑蜂王台病毒病原特征

2.病害防治

通常情况下，受到黑蜂王台病毒感染的蜜蜂当发现感染时已经说明蜜蜂体内黑蜂王台病毒已经达到一定数量，各组织器官也已经受到了严重的损伤。因此，根据黑蜂王台病毒检测结果、病原、传播途径等特征进行分析，得出针对其病害防治措施主要包括两种：一种为物理防治措施，另一种为药物防治措施。其中物理防治措施主要针对蜂农而言，在蜜蜂养殖过程中通过对蜂场、蜂具以及饲料的卫生清洁和消毒，预防黑蜂王台病毒的产生，还可以通过选育抗黑蜂王台病毒蜂种进行预防。药物防治措施可通过使用抗病毒药物或中草药喂食蜜蜂的方式预防。在实际应用过程中，药物防治产生的药物残留会对蜜蜂健康及蜂产品造成不同程度污染。应根据具体情况选择对应的防治措施，从而将损失降到最低。

除此之外，还可采用RNA干扰技术对黑蜂王台病毒进行防治，根据本文论述可知，通过检测的方式可对该病毒的基因进行定量和定性，通过RNA干扰技术对病毒进行针对性的沉默或下调某个基因结构的方式，降低病毒的表达水平，从分子结构上，削弱或消除黑蜂王台病毒的增殖能力。

三、结束语

当前，生物技术正处于高速发展的时期，生物检测技术与分析工具得到了不断地完善和创新，这些技术涉及到对生物蛋白质组、代谢产物、转录组等分析，同时也涉及到对海量生物数据的分析与处理。尽管当前大部分的生物技术价格高昂，在一定程度上限制了新技术的应用与推广，但它是一种功能强大、效率极高的生物手段。本文通过对黑蜂王台病毒基因检测及其病害诊断防治方法，以威胁蜜蜂健康状况常见的病毒为例，结合定量逆转录技术可以有效实现对病毒的定性和定量，以此为蜜蜂养殖及蜂产品生产质量和安全提供保障。