慢性乙型肝炎患者病毒载量、PD-L1与肝纤维化及肝组织炎症活动度的相关性分析

刘 甜，张 伟，梁俊荣， 徐 娜，张 婧，魏娟宁

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是患者感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)后发生的持续感染，所导致的乙型肝炎慢性化的消化系统传染性疾病[1-2]。乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid, HBV DNA)病毒载量是病毒复制、活动的标志，该病病情的进展、预后与HBV DNA之间有密切联系[3-4]。相关研究指出，CHB患者的免疫功能异常，T淋巴细胞质量及数量上有缺陷，机体无法通过自身细胞免疫功能清除HBV病毒[5]。程序性死亡因子配体1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)可以诱导T细胞凋亡，参与T细胞活化的过程并可发挥正性调控的作用，PD-L1的表达与CHB患者病情进展有着显著相关性[6]。为进一步了解HBV DNA、PD-L1及肝纤维化对CHB患者肝组织炎症活动度的影响，本研究选取了本院收治的102例CHB患者，分别探讨了乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)表达阳性患者及HBeAg表达阴性患者的病理学指标情况，为临床治疗CHB患者提供理论指导。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2018年4月—2019年4月本院收治的102例CHB患者的临床资料。①纳入标准：均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中的诊断标准[7]；临床资料完整；纳入研究前未接受过抗病毒治疗；年龄为21～78岁；对本研究知情并签署同意书。②排除标准：合并甲型、丙型等其他类型的肝炎患者；长期嗜酒者；有长期特殊药物服用史者；因精神障碍无法配合治疗者。按照HBeAg表达不同分为HBeAg阳性组72例和HBeAg阴性组30例。HBeAg阳性组男39例，女33例；年龄21～75(43.85±3.54)岁。HBeAg阴性组男18例，女12例；年龄23～78(43.91±3.59)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1HBV DNA测定：采用美国ABI公司提供的ABI 5700型荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪测定3组患者的HBV DNA，试剂盒由广州达安基因股份有限公司提供。检测过程应严格按照说明书进行。

1.2.2生化指标检测：2组均于入院次日清晨空腹抽取静脉血10 ml，去肝素锂抗凝，采用密度梯度法分离单个细胞核，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)等量稀释，加入10 ml淋巴细胞分层液中，离心后吸取单个核细胞层，PBS洗涤3次后重悬，在流式细胞仪上测定PD-L1水平。操作过程严格按照说明书流程完成。

1.2.3病理组织检查：采用1 s快速穿刺肝组织活检术采集肝脏组织，长度为1.5～2.0 cm。采集到的标本使用4%甲醛溶液固定，经常规石蜡切片、脱水后，使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光学显微镜观察分析，并依据《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[7]进行病理分级。整个实验操作过程严格按照说明进行。

2 结果

2.1CHB患者肝组织病理活检结果 102例CHB患者根据肝纤维化程度分级[8]分组：S1组21例，S2组52例，S3～S4组29例；根据炎症活动度分组：G1组10例，G2组56例，G3～G4组36例。

2.2HBV DNA、PD-L1表达水平比较 HBeAg阳性组HBV DNA、PD-L1表达水平显著高于HBeAg阴性组(P<0.01)。见表1。

表1 2组CHB患者HBV DNA、PD-L1表达水平比较

2.3HBeAg阴性组肝纤维化程度、炎症活动度与HBV DNA及PD-L1表达比较 将HBeAg阴性组30例按照肝纤维化程度分为S1组6例，S2组15例，S3～S4组9例；3组间HBV DNA、PD-L1表达比较差异无统计学意义(F=0.030、0.001，P>0.05)。根据炎症活动度将HBeAg阴性组分为G1组4例，G2组9例，G3～G4组17例。3组间HBV DNA、PD-L1表达比较差异无统计学意义(F=1.790、0.060，P>0.05)。见表2。

表2 HBeAg阴性的CHB患者肝纤维化程度、炎症活动度与HBV DNA、PD-L1表达比较

2.4HBeAg阳性的CHB患者肝纤维化程度、炎症活动度与HBV DNA、PD-L1表达比较 将HBeAg阳性组按照肝纤维化程度分为S1组15例，S2组37例，S3～S4组20例，3组HBV DNA、PD-L1表达水平比较差异有统计学意义(F=8.890、7.220，P<0.05)。根据炎症活动度将HBeAg阳性组分为G1组6例，G2组47例，G3～G4组19例。3组HBV DNA、PD-L1表达水平比较有统计学意义(F=7.090、6.590，P<0.05)。见表3。

表3 HBeAg阳性CHB患者肝纤维化程度、炎症活动度与HBV DNA、PD-L1表达比较

2.5不同HBeAg表达的CHB患者炎症活动度分级、肝纤维化程度与HBV DNA、PD-L1相关性分析 HBeAg阳性CHB患者中，HBV DNA与炎症活动度分级及肝纤维化程度均呈正相关(r=0.454、0.398，P<0.05)；PD-L1与炎症活动度分级及肝纤维化程度也均呈正相关(r=0.428、0.356，P<0.05)。HBeAg阴性CHB患者HBV DNA、PD-L1与炎症活动度分级、肝纤维化程度分级均无相关性(P>0.05)。见表4、表5。

表4 HBeAg表达阳性的CHB患者炎症活动度分级、肝纤维化程度与HBV DNA、PD-L1相关性分析

表5 HBeAg表达阴性的CHB患者炎症活动分级、肝纤维化程度与HBV DNA、PD-L1相关性

3 讨论

既往研究认为，CHB患者体内细胞免疫功能低下，导致HBV在机体内不断复制，使肝细胞免疫病理损伤，引发持续感染导致患者病情加重。细胞免疫应答过程中，辅助性调节性T细胞均可影响细胞毒性T细胞，使其细胞数目及功能产生变化[9-10]。PD-L1属于CD28/CT-LA-4家族，是一种共刺激分子。既往研究报道，PD-L1为调节抗HBV特异性T细胞免疫的关键分子，其提供的正向信号与慢性HBV感染关系极为密切[11]。文献报道，HBV DNA升高可作为反映HBV复制最敏感的检测指标之一[12]。本研究结果显示，HBeAg阳性组HBV DNA、PD-L1表达显著高于HBeAg阴性组，进一步证实了CHB患者HBeAg表达与HBV DNA、PD-L1之间存在密切联系。有学者研究报道，HBeAg表达水平与血清病毒载量及PD-L1水平变化具有一致性[13]。分析其原因为HBeAg是一种可溶性蛋白，现临床多依据HBeAg水平了解病毒复制、传染及患者病情进展情况，在部分CHB患者体内核心区启动子出现变异，导致HBeAg无法合成，所以会出现阴性表达，因此HBeAg阴性无法证明HBV复制水平降低或HBV已经清除[14]。CHB是一种免疫介导性疾病，发病机制尚未明确，主要为肝细胞表面抗原与宿主的免疫应答损害肝脏细胞[15]。HBeAg作为免疫耐受因子，HBeAg表达阳性可使CHB患者机体处于免疫耐受状态，可见HBV DNA与肝脏损害程度之间无明显联系。HBeAg阴性的CHB患者HBV DNA不高，但患者机体内水平未保持在平衡状态，也会使病情发展，影响预后。赵明英和李春林[16]在相关研究中证实了这一观点。

国内外有较多学者报道，CHB患者与HBV DNA、PD-L1、肝纤维化及肝组织炎症活动度之间的关系，但结果尚未达成一致[17-18]。本研究考虑到CHB患者体内HBeAg表达水平存在差异，分别研究了HBeAg阳性及HBeAg阴性患者体内HBV DNA、PD-L1表达情况及肝纤维化程度、肝组织炎症活动度。结果显示不同肝纤维化程度及炎症活动度的HBeAg阴性组CHB患者HBV DNA、PD-L1水平比较差异无统计学意义；不同肝纤维化程度及炎症活动度程度的HBeAg阳性组CHB患者HBV DNA、PD-L1水平比较差异有统计学意义。与既往研究报道结果相似[19]。

本研究结果显示，HBeAg阳性组CHB患者中，HBV DNA、PD-L1与炎症活动度分级、肝纤维化程度呈正相关，可见HBV DNA及PD-L1水平越高，患者肝脏组织损伤程度越重；HBeAg阴性CHB患者中，HBV DNA、PD-L1与炎症活动度分级、肝纤维化程度之间无显著相关性，这一研究结果与Rao等[20]报道结果一致。考虑为HBeAg阳性的CHB患者乙型肝炎病毒的复制水平提高，会加速肝脏的损害程度，引发肝癌、肝硬化等恶性疾病的发生[21-22]。这提示临床医师对于HBeAg表达阳性CHB患者在治疗时，可通过给予患者抗病毒治疗阻碍肝脏病变的进一步发展；同时可加强监测CHB患者的HBV DNA、PD-L1，了解患者病情变化，制定有效的治疗方案，减少肝脏癌变的概率，以保证患者生命健康，延长生存期[23]。

综上所述，本研究初步探讨了HBV DNA、PD-L1表达与其肝纤维化及肝组织炎症活动度的相关性，结果显示HBeAg阳性的CHB患者高HBV DNA、PD-L1表达会加重肝脏损害，而HBeAg阴性的CHB患者上述指标之间无显著相关性。但PD-L1在CHB患者中作用机制尚未明确，且本研究纳入样本量较少，CHB患者体内HBeAg阴性表达及HBeAg阳性表达中HBV DNA、PD-L1水平与肝脏损害之间的相关性仍有待扩大样本量，延长研究时间进一步探讨。