高通量基因序列在免疫抑制合并肺炎患者肺泡灌洗液感染病原中的应用

周佳琦　马肖龙

[摘要] 目的 探討高通量基因序列（NGS）联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者肺泡灌洗液感染病原中的应用效果及ROC曲线分析。 方法 选择2017年1月至2019年12月在我院治疗的免疫抑制合并重症肺炎患者50例为研究对象，随机分为对照组（25例）和观察组（25例），对照组予经验性广谱抗菌药物治疗，观察组在对照组的基础上予肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析方法检测患者病原学并指导抗生素的使用。比较两组生化指标及不良反应发生情况，绘制ROC曲线，分析肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析方法在免疫抑制合并重症肺炎患者中的治疗指导效能。 结果 两组治疗后酸碱度（pH）水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。观察组治疗后白细胞计数（WBC）、中性粒细胞水平低于对照组，动脉血氧分压（PaO2）、血氧饱和度（SaO2）水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组患者不良反应总发生率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。ROC曲线分析结果显示，NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者中的治疗指导效能均高于单一NGS和质谱分析，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 基于肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析用于免疫抑制合并重症肺炎患者的治疗，能获得良好的治疗效果，降低并发症发生率，可指导临床治疗，值得推广应用。

[关键词] 肺泡灌洗液感染病原;高通量基因序列;质谱分析;免疫抑制合并重症肺炎;ROC曲线

[中图分类号] R563.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）06-0038-04

Application of next generation sequencing in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with pneumonia

ZHOU Jiaqi   MA Xiaolong

Department of Respiratory Medicine， the First Hospital of Jiaxing in Zhejiang Province， Jiaxing   314000， China

[Abstract] Objective To explore the application effect and ROC curve analysis of next generation sequencing （NGS） combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with severe pneumonia. Methods Fifty patients with immunosuppression combined with severe pneumonia from January 2017 to December 2019 treated in our hospital were selected as research subjects and randomly divided into the control group（n=25） and the observation group （n=25）. Empirical broad-spectrum antibacterial drug therapy was given to the control group， and NGS combined with mass spectrometry of alveolar lavage fluid infection pathogen was given to the observation group on the basis of the control group to detect the pathogen and guide the use of antibiotics. The ROC curve was drew， the therapeutic guidance effectiveness of NGS combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with severe pneumonia was analyzed， and the curative effect and the adverse reaction were compared in the two groups. Results It was found that there was no statistically significant difference in pH after treatment between the two groups（P>0.05）. The white blood cell count （WBC） and neutrophils after treatment in the observation group were statistically significant lower than those in the control group， the partial arterial oxygen pressure（PaO2） and the blood oxygen saturation（SaO2） after treatment in the observation group were statistically significant higher than those in the control group （P<0.05）. The incidence rates during the treatment in the observation group was statistically significant lower than that in the control group（P<0.05）. ROC curve result showed that the guidance effectiveness of NGS combined with mass spectrometry in patients with immunosuppression combined with severe pneumonia was statistically significant higher than that of single NGS and mass spectrometry （P<0.05）. Conclusion The application of NGS combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with pneumonia has good curative effect， and can reduce the incidence of complications and guide the clinic treatment， which is worthy of popularization and application.

[Key words] Alveolar lavage fluid infection pathogen; Next generation sequencing; Mass spectrometry; Immunosuppression combined with pneumonia; ROC curve

肺炎的严重程度取决于局部炎症程度、肺部炎症的播散及全身炎症反应程度，肺炎患者如出现较为严重的低氧血症或呼吸衰竭需要通气支持，或出现低血压、休克等循环衰竭表现，或出现其他器官功能障碍，均可判定为重症肺炎[1]。对于免疫抑制合并重症肺炎患者，由于其自身免疫调节异常，容易造成广泛组织损伤，再加上患者治疗时需要长期应用糖皮质激素或其他免疫抑制剂，导致其细胞体液免疫受到抑制，造成机体抵抗力降低，容易增加感染发生率[2-3]。近年来，随着肿瘤放化疗技术、器官移植技术的发展及糖皮质激素的广泛应用，免疫抑制患者呈增加及积累趋势[4-5]。高通量基因序列（Next generation sequencing，NGS）技术具有检测速度快、准确率高、覆盖面广及产出巨大等特点，成为当前研究的热点[6]。NGS分析和诊断能够快速、精准地诊疗急危重症感染，而肽和蛋白的质谱序列测定则具有快速、用量少及易操作等优点[7-8]。因此，本研究以免疫抑制合并重症肺炎患者为研究对象，探讨NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎中的应用效果及ROC曲线分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2019年12月在我院治疗的免疫抑制合并重症肺炎患者50例为研究对象，随机分为对照组和观察组。对照组25例，男15例，女10例;年龄26～72岁，平均（53.25±2.26）岁;IgA肾病8例，膜性肾病10例，难治性肾病综合征3例，狼疮性肾炎4例。观察组25例，男13例，女12例;年龄27～73岁，平均（54.41±2.34）岁;IgA肾病6例，膜性肾病11例，难治性肾病综合征5例，狼疮性肾炎3例。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

纳入标准：①符合重症肺炎诊断标准[9];②符合肾病诊断标准，且均伴有不同程度的免疫抑制，包括血液系统肿瘤、实体恶性肿瘤、肿瘤化疗、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染、免疫抑制剂治疗。排除标准：①合并精神异常、血液系统疾病或器质性疾病;②合并认知功能异常、自身免疫系统疾病或全身炎症反应;③合并全身难以控制的感染性疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 方法

对照组：①早期经验性给予广谱抗菌药物治疗，再根据病原学检查、药敏试验及疗效进行进一步调整;②及时调整免疫抑制剂用量;③营养支持，补充必要能量及维生素，纠正低蛋白血症[10-11]。观察组：在对照组的基础上采用肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析方法检测患者病原学，并指导抗生素的使用，具体方法如下：患者入组后，于局麻下将纤维支气管镜（北京科斯佳有限责任公司）插入右肺中叶或左肺舌段支气管内，将其项端契入支气管分支开口，通过气管活检将100～250 mL 37℃生理盐水缓慢注入，采用少量多次的原则注入，注入后给予适当的负压吸出，将吸出液收集在硅油处理后的容器中，快速送检。采用肺泡灌洗液感染病原NGS（武汉华大医学检验所）联合质谱分析方法检测患者病原学，同时进行药敏试验，根据测定结果选择敏感抗生素进行治疗，定期检测患者的血、尿及痰细菌培养，完成巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、IgG、IgM等检查，根据患者病情定期复查血常规、血气及血电解质，根据检查结果调整药物治疗方案。

1.3 观察指标及评价标准

①生化指标水平。两组治疗前、治疗后14 d次日取空腹静脉血5 mL，离心后采用全自动生化分析仪测定患者白细胞计数（White blood cell count，WBC）、中性粒细胞水平;采用血气分析仪测定患者动脉血氧分压（Partial arterial oxygen pressure，PaO2）、血氧饱和度（Blood oxygen saturation，SaO2）及酸碱度（pH）水平[12]。②不良反应发生情况。记录两组患者治疗过程中恶心呕吐、腹泻、血压波动、肝肾异常、向心性肥胖的发生情况。③治疗指导效能。绘制ROC曲线，分析NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者中的治疗指导效能[13-14]。

1.4統计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验;计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生化指标比较

两组治疗前生化指标水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;两组治疗后pH水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;观察组治疗后WBC、中性粒细胞水平低于对照组，PaO2及SaO2水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2两组不良反应发生情况比较

观察组患者不良反应总发生率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者中的治疗指导效能

ROC曲线结果显示，NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者中的指导效能[敏感度（91.35%）、特异度（90.18%）]均高于单一NGS[敏感度（72.91%）、特异度（69.71%）]和质谱分析[敏感度（79.81%）、特异度（76.45%）]，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

指导效能

3 讨论

重症肺炎临床发生率较高，是在伴有心肺基础疾病或附加危险因素基础上感染的肺炎，其常见的特殊病原微生物包括SARS病毒、军团菌等，均会增加肺炎的严重程度及死亡风险[15]。临床研究结果显示[16]，重症肺炎在年龄>65岁，存在基础疾病，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖尿病及慢性肝病等，或伴有意识异常、脾切除术后等患者中发生率较高，临床多表现为呼吸衰竭、意识障碍等。近年来，基于肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者治疗中得到应用，且效果理想[17-18]。本研究中，两组患者治疗后pH水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;观察组治疗后WBC水平低于对照组，PaO2及SaO2水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示基于肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析能指导免疫抑制合并重症肺炎患者的临床治疗，有助于改善患者血气及血常规检测水平，利于患者恢复。基于肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析能结合两种技术的优点，包括检测速度快、准确率高、成本低及覆盖面广等，对于感染性疾病的早期诊断、控制疾病传播、治疗进展及预后评估具有一定的优势。我国质谱分析与NGS技术在临床与实验中的应用相对较广，而二者联合使用能实现诸多疾病的诊断与治疗[19]。本研究中，观察组治疗过程中的不良反应总发生率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示基于肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析检测能发挥两种检测方法的优势，准确地指导患者临床用药，利于患者恢复[20]。本研究中，ROC曲线结果显示，NGS联合质谱分析在免疫抑制合并重症肺炎患者中的指导效能（敏感度、特异度）均高于单一NGS和质谱分析，差异有统计学意义（P<0.05）。因此，免疫抑制合并重症肺炎患者治疗时应加强其肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析测定，以评估患者预后、指导临床治疗，使得患者的治疗更具科学性。

综上所述，基于肺泡灌洗液感染病原NGS联合质谱分析用于免疫抑制合并重症肺炎患者的治疗，能获得良好的治疗效果、降低不良反应总发生率，可指导临床治疗，值得推广应用。

[参考文献]

[1] 王卫.长期使用免疫抑制剂合并重症肺炎患者应用连续性肾脏替代治疗临床效果观察[J].实用药物与临床，2018，21（7）：786-790.

[2] 王丹，刘春峰，张国安，等.重症肺炎合并先天性心脏病患儿万古霉素血药浓度分布特点分析及临床疗效观察[J].中国小儿急救医学，2018，25（10）：737-740.

[3] 虞竹溪，张北源，许莹，等.免疫功能抑制患者发生血流感染的临床特征分析[J].中华危重病急救医学，2018， 30（11）：1087-1090.

[4] 赵丹，宁睿，王春艳，等.不同预后的重症肺炎患者住院期间血清和肺泡灌洗液TLR4水平、外周血免疫细胞计数比较[J].山东医药，2017，57（15）：96-98.

[5] Andrea ND，Laura LH，Julia K，et al.Safety of induced sputum collection in children hospitalized with severe or very severe pneumonia[J].Clinical Infectious Diseases，2017， 64（Suppl 3）：S301-S308.

[6] 李蓉，吴秀慧，李志波，等.重症肺炎合并心力衰竭患兒血清NT-proBNP、cTnI和H-FABP的表达水平及其与心功能的关系[J].中西医结合心脑血管病杂志，2019， 17（10）：1510-1512.

[7] 刘孝荣，马东礼，姜含芳，等.高通量测序方法在重症肺炎病原体检测的应用[J].中华检验医学杂志，2017，40（8）：609-613.

[8] Jing H，Jiquan G，Hongtao L，et al.Efficacy and safety of adjunctive corticosteroids therapy for patients with severe community-acquired pneumonia：A systematic review and meta-analysis[J].Medicine，2019，98（13）：e14 636.

[9] 李学青，王丽娜，张俐，等.肺泡灌洗液二代基因测序对儿童重症肺炎病原学诊断应用观察[J].中国实用儿科杂志，2019，34（6）：513-516.

[10] Yuanlin S，Chen Y，Yongming Y，et al.Xuebijing injection versus placebo for critically ill patients with severe community-acquired pneumonia：A randomized controlled trial[J].Critical Care Medicine，2019，47（9）：1.

[11] 和建武，向丽，程西安，等.早期CRRT干预对重症肺炎合并急性肾损伤患者免疫功能的影响[J].国际呼吸杂志，2019，39（9）：676-679.

[12] 高延秋，张根生，李双凤，等.血管外肺水指数联合血管内皮生长因子受体1对重症肺炎ARDS合并感染性休克患者预后的评估[J].中华急诊医学杂志，2018，27（12）：1381-1387.

[13] 王新平.血清肺表面活性蛋白D、可溶性髓样细胞触发性受体-1检测对老年重症肺炎合并呼吸衰竭患者病情判断和预后评估[J].中国临床医生杂志，2019，47（8）：923-926.

[14] Fatima B，Aimee B，Simon P.Travis post-marketing experience of vedolizumab in inflammatory bowel disease：Analysis of pneumonia and other respiratory tract infections[J].Gastroenterology，2017，152（5）：S580.

[15] 濮雪华，揭红英，缪小莉，等.支气管肺泡灌洗对重症肺炎合并呼吸衰竭患者正五聚体蛋白-3水平的影响[J].中华老年多器官疾病杂志，2019，18（8）：588-592.

[16] Claudia D，Felix B，Mario M，et al.Long-term sequelae of acute respiratory distress syndrome caused by severe community-acquired pneumonia：Delirium-associated cognitive impairment and post-traumatic stress disorder[J].Journal of International Medical Research，2018，46（6）：030 006 051 876 204.

[17] 王俊，周婷.纤支镜肺泡灌洗联合振动排痰治疗对ICU治疗的重症肺炎患者血气指标及肺功能的影响[J].标记免疫分析与临床，2019，26（8）：1325-1328.

[18] Antoine R，Hamish W，Cedric J，et al.Local modulation of antigen-presenting cell development after resolution of pneumonia induces long-term susceptibility to secondary infections[J].Immunity，2017，47（1）：135-147.

[19] 徐俊馬，赵杰，贾晓民，等.早期连续性肾脏替代治疗在重症肺炎集束化治疗中的应用[J].中华危重病急救医学，2018，30（3）：246-250.

[20] 李志刚，郑太祖，张银军，等.贞芪扶正颗粒在抢救重症肺炎呼吸衰竭患者中的作用[J].中国中西医结合急救杂志，2019，38（4）：420-422.

（收稿日期：2020-03-18）