基质辅助激光解吸附电离质谱成像技术在帕金森病研究中的应用

王磊，朱婷，董曦，于淼，孙桂波*（1.哈尔滨商业大学，哈尔滨 150006；.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，中药（天然产物）创新药物研发北京市重点实验室，中草药物质基础与资源利用重点实验室，天然药物、健康产品的研究与开发实验室，中国医学科学院基于经典名方的新药发现重点实验室，北京 100193）

帕金森病（PD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病，是一种常见的运动障碍性疾病，多发于老年人群，其患病率在神经系统退行性疾病中仅次于阿尔茨海默病（AD）[1]。PD 临床症状主要表现为震颤、肌肉僵直、运动迟缓、步态失调、自主神经功能紊乱、嗅觉功能减退、感觉障碍等。多数PD 是先天的，并可通过基因遗传[2]。PD 的主要病理变化是中脑黑质纹状体多巴胺能神经元的缺失和路易小体的沉积[3-5]。目前，临床上对脑组织生物切片进行研究的手段主要为免疫组织化学技术，该方法敏感性高、特异性好，但该方法耗时较长，难以对多种分子同时显色成像[6]。

质谱（MS）已广泛用于生物分子的分析，质谱成像技术（MSI）已成为直接检测组织样品中生物分子的强大工具，包括蛋白质[7]、肽[8]、代谢产物[9-11]、磷脂[12-13]和药物[14]等。相较于传统的MS 技术，MSI 无需对样品进行复杂的前处理，且能保留物质的原位信息，这些特点使得MSI 分析方法在生物标志物的识别、代谢机制的研究、刑事科学及食品科学等领域均有广泛的应用前景[15-18]。目前，在MSI 的研究中，最重要的电离源是基质辅助激光解吸/电离（MALDI）、二次离子质谱（SIMS）和解吸电喷雾电离（DESI）[19-20]。与 MALDI成像相比，SIMS 与DESI 成像的主要优势是不需要外加基质辅助电离，工作流程更便捷，因而在实时临床病理诊断上更有优势。然而，SIMS 与DESI 成像很难对大分子量的化合物（如多肽、蛋白及核酸等）进行分析，且DESI 成像的空间分辨率精度较低[6，20]。而MALDI-MSI 技术由于其具有无需任何标记、能够快速高效地对组织表面生物分子进行高通量成像分析的优势，成为对生物分子进行空间分析的强大工具[21]。本文将简要评述MALDI-MSI的工作原理及其进展，着重介绍近年来MALDIMSI 在帕金森病中的应用。

1 MALDI-MSI 简介

1.1 工作原理

MALDI-MSI 的基本工作原理是将不同分析物样本分散在基质分子中形成样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射结晶体，基质分子经辐射所吸收的能量使样本吸附，基质与样本间发生电荷转移从而使样品分子电离，样本离子经高压加速、聚焦后进入飞行时间质谱分析器进行质量分析，示意图见图1。检测器将检测到的不同质荷比（m/z）的离子以质荷比为横坐标，离子峰为纵坐标与图谱库进行对比，得到鉴定结果并最终确定离子在样本组织内的分布[22-23]。

图1 MALDI-MSI 工作原理示意图Fig 1 Schematic diagram of MALDI-MSI working principle

在成像的过程中，首先需要将吸收紫外光的有机小分子基质均匀地沉积在待分析的组织切片上，然后将已沉积基质的切片送入装有MALDI离子源的质谱仪，使用紫外波长的激光对切片进行轰击。切片表面的有机基质吸收紫外光后，将能量和电荷传递给生物分子，辅助它们解吸电离，利用聚焦电离源（带电雾滴、激光、离子源）在样品切片组织上逐点轰击即可得到分子在该切片上的空间分布图[6]。

1.2 工作流程

对福尔马林石蜡包埋或新鲜冷冻组织样品进行MALDI-MSI 分析：先将组织切成10 μm 薄片并均匀平整地贴在适当的导电载玻片上（新鲜冷冻组织可以直接用于基质喷涂，而福尔马林石蜡包埋组织需要去石蜡和抗原修复）；接下来，在玻片上喷洒MALDI 基质，基质的选择对实验成功至关重要，MALDI-MSI 实验中最常使用的基质有2，5-二羟基苯甲酸、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸（芥子酸）和α-氰基-4-羟基肉桂酸；基质喷洒后，通过激光束照射载玻片到选定的组织区域来收集成像质谱，从获取的质谱图生成的离子图像与组织学染色的组织进行比较，以研究目标分析物在特定组织学特征内的分布[24]，示意图见图2。

图2 MALDI-MSI 工作流程示意图Fig 2 Schematic diagram of MALDI-MSI workflow

2 MALDI-MSI 在中枢神经系统疾病研究中的优势

中枢神经系统疾病（central nervous system，CNS）以特异性神经元的大量丢失为主要特征，是一类进行性发展的可致残，严重可致死的复杂疾病，其主要包括AD、PD、亨廷顿病（HD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、脑血管疾病（包括中风、偏头痛和其他头痛疾病）及因头部外伤引起的神经系统外伤[25-26]。而CNS 发病机制十分复杂，因此在分子水平上阐明神经系统疾病致病过程，以及各个脑区的能量代谢、神经递质和细胞表型的变化是十分必要的。在之前的动物实验研究中[27]，为了检测这些小分子的变化，如ATP、葡萄糖、谷氨酸等，需要获取所需要的脑组织制备成组织匀浆或者通过微量透析的方法取脑细胞间隙液进行LC-MS、ELISA 实验。虽然核磁共振（NMR）也可以分析脑区的小分子分布和含量，但是由于NMR 能够检测的小分子种类有限，分辨率低，使分子结构接近的物质信号难以区分。因此建立一种能够在组织上原位检测这些小分子的技术对于中枢神经系统疾病研究十分必要。

与传统的生物组织成像技术相比，MALDIMSI 最重要的特点就是高通量，即能够同时检测大量物质，且具有无标记检测的能力。其次，其无需对完整的组织进行研磨便可以直接进行质谱检测，反映物质分布的空间信息。此外，MALDI-MSI 通过与解剖图谱进行对比，将不同脑区精确定位[9，27-28]，从而将复杂脑组织简单化，不仅能为组织结构学、代谢学研究提供新思路，并且样品处理简便，可用于大量生物样品的快速检测[19，24]。

3 MALDI-MSI 在PD 研究中的应用

近年来，MALDI-MSI 被广泛用于PD 脑组织成像，研究内容包括MALDI-MSI 在PD 动物模型中的应用、靶向MALDI-MSI 用于PD 动物模型的验证、动物模型中PD 相关蛋白的靶向性MALDI-MSI研究、MALDI-MSI 探索PD动物不同脑区的差异蛋白质组效应、MALDI-MSI 定位PD 患者神经递质的变化和MALDI-MSI 检测新型PD 药物在啮齿类动物脑内的空间分布。

3.1 MALDI-MSI 在PD 动物模型中的应用

迄今为止，利用MALDI-MSI 进行蛋白质组学研究已经应用于一些PD 动物模型。其中，MALDI-MSI 研究的一个模型是通过立体定向手术将6-羟基多巴胺（6-OHDA）单侧注射到黑质致密部（SNPC），通过多巴胺和去甲肾上腺素转运体摄取后使多巴胺能神经元退化[29]。6-OHDA的毒性来源于其被单胺氧化酶B（MAO-B）氧化，此外，6-OHDA 经过自动氧化，产生过氧化氢、活性氧化物和儿茶酚胺醌。因电子传递链复合物I 的功能受损，线粒体功能也受到6-OHDA的影响[30]。

MALDI-MSI 研究的另一种帕金森病模型是通过向啮齿动物大脑的一侧注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP），该模型再现了灵长类帕金森病的所有临床表现，但没有形成路易氏包涵体[31]。与6-OHDA 不同，MPTP很容易通过血脑屏障，随后在星形胶质细胞中被MAO-B 氧化成N-甲基4-苯基吡啶（MPP＋）。MPP＋是一种实际的神经毒性化合物，由突触前再摄取系统在细胞内积累，并通过线粒体复合物I 抑制电子传递，最终导致细胞死亡[32-33]。

3.2 靶向MALDI-MSI 用于PD 动物模型的验证

Kadar 等[34]研究MPTP 模型的临床有效性，应用MALDI-MSI 研究经鼻给药后小鼠脑组织中神经毒性成分MPP＋的分布。空间分辨率为70 μm 的MPP＋对应的m/z的离子图像显示，MPTP给药10 min 后，化合物几乎可以在整个大脑中检测到；而90 min 后，MPP＋主要集中在多巴胺能区，包括SNPC。以上发现有力地支持了鼻腔给药是研究PD 有效模型的重要途径。

3.3 MALDI-MSI 研究动物模型中PD 相关蛋白的靶向性

FKBP-12 是实验性帕金森病药物他克莫司（FK506）的结合位点，在实验性帕金森病模型中具有神经保护和神经再生的特性[35-37]。Nilsson等[38]的研究旨在探讨免疫亲和素蛋白FKBP-12是否在6-OHDA 单半球受损大鼠脑的纹状体中显示出解剖学表达差异。应用MALDI-MSI 技术，作者发现FKBP-12（m/z11791）离子强度在损毁大鼠纹状体背侧和内侧升高，但在腹侧无明显变化[38]。该发现为PD 药物研究提供了新视角。

神经肽是大脑中重要的信号分子，其表达水平的变化与PD 等神经疾病有关[39-40]。Hulme 等[40]采用单侧6-OHDA PD 大鼠模型，通过MALDIMSI 检测脑啡肽、强啡肽、速激肽和神经降压素与多巴胺能去神经和左旋多巴治疗相关的变化，研究在多个脑区成像脑啡肽、强啡肽、速激肽、神经降压素与多巴胺能去神经和左旋多巴治疗相关的变化。利用高横向分辨率成像观察到多巴胺耗竭后苍白球背侧亚区神经降压素增加。这项研究表明质谱成像在阐明PD 及其治疗过程中神经肽信号的动态变化的能力。

3.4 MALDI-MSI 探索PD 动物不同脑区的差异蛋白质组效应

一项MALDI 图谱研究，调查了左旋多巴（L-DOPA）对6-OHDA 处理的大鼠12 个感兴趣脑区的影响。在L-DOPA 治疗组中，有7 个m/z峰在两个半球的相应位置表达有差异，而在生理盐水对照组中表达没有差异。这些差异表达的多肽中有5 个位于6-OHDA 损伤的纹状体，3 个纹状体峰可被鉴定为钙调蛋白和细胞色素c 氧化酶亚基V Ⅱa-L 和细胞色素c 氧化酶。且翻译后修饰（PTM）的新位点在大脑多巴胺缺乏一侧的纹状体中表达增加，而这种变化在L-DOPA 治疗后减弱，表明L-DOPA 对6-OHDA 损伤大鼠的治疗作用主要定位于纹状体区[41]。

蛋白水解酶的脑区特异性表达可以控制内源性神经肽的生物活性，最近已成为治疗神经病理性疼痛、癌症和PD 的新药开发的靶点。Bivehed等[42]分析了强啡肽B 作为模型神经肽的转化和降解产物，以及肽酶抑制剂在不同脑区脑组织切片上的应用效果。结合原位酶组织化学和MALDI-MSI 法发现，在皮层产生强啡肽B（1-7），在纹状体产生强啡肽B（2-13）[42]。

3.5 MALDI-MSI 定位PD 患者神经递质的变化

Shariatgorji 等[43]采用2，4-二苯基吡喃四氟硼酸盐（DPP-TFB）衍生化伯胺为基质，采用MALDI-MSI 法检测了假手术、6-OHDA 和D3-LDOPA（6-OHDA）损伤后大鼠脑内多巴胺、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（GLU）和ACh 等低分子化合物。在6-OHDA 损伤的动物模型中，作者发现纹状体多巴胺水平降低，GABA 水平升高。而 PD 的发病机制研究主要基于神经信号传递的改变，因此推测这些神经递质在脑组织中的改变可能与PD 的发病机制有关。

SNPC的多巴胺能神经元可以高度支配壳核和尾状核，帕金森患者大脑壳核和尾状核中存在多巴胺能纤维的丧失（帕金森病的典型特征）。此外，尽管患有帕金森的患者死亡时间很长后仍然能够检测到其他生物学上重要的神经递质（NT）。Shariatgorji 等[44]将2-氟-1-甲基吡啶鎓（FMP-10）用于帕金森纹状体人脑组织切片的成像，选择尾状核，内膜荚膜和壳核用于MALDI-MSI 分析，并使用20 µm 的横向分辨率进行研究，发现在尾状核和壳核结构中都检测到NTs 和相关代谢产物，如多巴胺和3-甲氧基酪胺（3-MT)，而荚膜内部这些代谢物水平相对较低，表明衍生的DA 及其代谢物3-MT 大部分位于腹侧尾状核。

3.6 MALDI-MSI 检测新型PD 药物在啮齿类动物脑内的空间分布

MALDI-MSI 已被用于治疗PD 进展的新药研究中。喹恶啉衍生物，如2-甲基-3-苯基-6-氨基-喹恶啉（MPAQ），对多巴胺能中枢神经系统神经元具有保护作用。在MPAQ 处理的小鼠上进行MALDI-MSI 实验，将HCCA 基质涂在14 μm厚的脑切片上，采集位点之间的距离为70 μm，结果发现MPAQ（m/z237.1）主要定位于纹状体和腹侧中脑[45]。该研究结果支持MAPQ 可以作为PD 神经保护治疗的候选药物。

4 结语

在过去十年中，针对神经退行性疾病和精神疾病的生物医学研究逐渐将MALDI-MSI 纳入对人和动物中枢神经系统组织中的蛋白质、脂质、神经肽和小分子疗法进行有针对性检测的研究中[6]。MALDI-MSI 技术在AD、PD、精神分裂症和ALS 研究领域已展开研究，而其他神经退行性和精神疾病（如抑郁症）则暂无相关应用。虽然样本量很小，而且许多研究的焦点都集中在证明该技术在神经和精神病学研究问题的适用性上，但这部分文献清楚地展示了MALDI-MSI 在未来研究项目中的潜力。在未来，MSI 应着重于定量方法学的发展。尽管不同研究组开展了质谱成像对药物或内源分子绝对浓度的测量方法，但利用质谱成像定量分析依然没有统一、稳定的方案。另外，目前MSI 在探索各种分子在中枢神经系统作用机制方面仍缺乏深入研究。通过结合多组学分析及分子生物学技术，MSI 将有望为CNS机制研究提供更大助力。