CD4+Treg细胞对变应性鼻炎患者外周血单个核细胞的作用

蔺林，戴飞，魏瑾瑾，陈峥

(复旦大学附属华山医院北院 耳鼻咽喉头颈外科，上海 200040)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是由IgE介导的针对吸入性特异性变应原的炎症反应，其主要临床症状包括鼻痒、打喷嚏、鼻塞和流清涕[1]。这种慢性疾病影响了全世界10%～40%的人口[2]，不仅影响人们的学习、工作，还降低了人们的生活质量，并且也是人们经常到医院就诊的直接原因[2]。 一项研究表明，我国AR患者的发病率从2005年的11.1%增加到2011年的17.6%[3]。

AR是Th2型炎症反应，涉及到多种细胞(树突状细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等)的参与[4-5]和多种II型细胞因子的产生和释放，比如白介素(interleukin，IL)-4、IL-5、IL-9和IL-13等[6]，其中，Th2细胞起到了关键性作用，包括AR的诱导、发展和持续[7]。但有关这种慢性炎症性疾病的调控机制目前还知之甚少[8]。很多研究证实，CD4+Treg细胞在AR的发病过程中起着调节免疫平衡和免疫耐受的作用，但其详细机制并不十分清楚[8]。本课题旨在探讨CD4+Treg细胞在体外对AR患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的作用，以明确该细胞在正常和炎症环境下的状态，为开发临床上可能用于治疗AR的CD4+Treg细胞疗法提供实验依据。

1 资料和方法

1.1 病例资料

选取15例健康志愿者为正常组，男8例，女7例，年龄28～56岁，中位年龄39岁；15例AR患者为AR组，男8例，女7例，年龄29～49岁，中位年龄39岁。两组临床资料分别同期在复旦大学附属华山医院北院耳鼻咽喉科受到招募。AR的诊断系按照allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) guidelines-2016 revision[1]和变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年，天津)[9]的建议，具有临床症状和体征，并且变应原皮肤点刺试验(skin prick test，SPT)阳性(其标准为皮肤表面风团面积大于7 mm2或直径>3 mm)(德国Allergopharma)，血清特异性IgE检测阳性(≥0.35 kU/L, 德国EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG)。本研究只选择对屋尘螨过敏的AR患者，其纳入标准包括：符合上述诊断的上海地区AR患者，年龄在18～75岁，性别不限。排除标准包括：上海地区AR患者但对粉尘螨变应原检测阴性、同时伴有间歇性或持续性中-重度哮喘、同时长期使用口服抗组胺药治疗或近1个月之内使用过全身激素治疗、同时伴慢性阻塞性肺部疾病、严重心脏病、肝硬化或尿毒症、女性患者妊娠期间、伴恶性肿瘤以及近3个月内参加过其他临床试验者。本研究得到复旦大学附属华山医院伦理委员会的批准(编号：2016-312)，所有患者均签署了知情同意书。

1.2 PBMCs的获取及体外培养

分别获取正常组和AR组静脉血40 mL，用葡聚糖-泛影葡胺梯度离心法(瑞典Pharmacia)得到PBMCs，一部分用于分离和提纯CD4+Treg细胞，一部分用于体外培养。以96孔板(每孔细胞数为1×106)对PBMCs进行培养(含RPMI 1640和10% FBS)，加入L-谷氨酰胺(2 mmol/L)、丙酮酸钠(91 mmol/L)、HEPES (20 mmol/L), 青霉素 (100 IU/mL), 庆大霉素 (50 ng/mL)，并加入屋尘螨(10 mg/mL)(美国MyBioSource)进行共培养5 d；然后在AR组的PBMCs中加入体外培养的CD4+Treg细胞，而正常组的PBMCs不予特殊处理，24 h后用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测培养液上清中IL-4和IL-5的浓度。

1.3 流式细胞仪分析

所获PBMCs细胞悬液经过离心(200×g)处理10 min后，将细胞浓度调成5×105/mL，细胞膜染色用抗CD4和CD25抗体，细胞内染色用Foxp3染色试剂盒(均购于美国MyBioSource)，严格按照厂家规定的步骤完成操作，对CD4+Treg细胞(表面分子特征为CD4+CD25+Foxp3+)进行分离并提纯，其提纯效率>95%，最后用流式细胞仪软件FlowJo(美国TreeStar)对该Treg细胞所占总CD4+T细胞百分比进行分析，所得数据用Becton Dickinson Cell Quest 软件进行分析。

1.4 CD4+ Treg细胞培养

CD4+Treg细胞在96孔板(每孔细胞数为1×105)中培养，每孔预先加入抗-CD3抗体(美国MyBioSource)，随后加入IL-2(1 000 IU/mL)(美国Abcam)，培养3 d。一部分CD4+Treg细胞培养基以ELISA法检测培养基上清中的IL-10和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β浓度，细胞裂解物用实时定量RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)法对IL-10和TGF-β的mRNA进行检测。一部分CD4+Treg细胞培养基中的细胞加入生理盐水制成细胞悬液(1×105cells/mL)，然后加到PBMCs培养基中进行体外干预实验。

1.5 ELISA实验

收集CD4+Treg和PBMCs细胞培养基上清液，以IL-10、TGF-β、IL-4和IL-5 ELISA试剂盒(购自美国MyBioSource)分别检测CD4+Treg细胞培养基中IL-10和TGF-β以及PBMCs细胞培养基中IL-4和IL-5的浓度，实验操作均严格按照厂家规定的步骤进行。

1.6 实时定量RT-PCR实验

收集CD4+Treg细胞培养基中细胞成分，采用实时定量RT-PCR法检测IL-10和TGF-β mRNA含量。IL-10和TGF-β的引物由上海捷兰生物技术有限公司设计，IL-10 mRNA上游引物：5'-CTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTC-3'，下游引物：5'-ATTCTTCACCTGCTCCACGGCCTT-3'，TGF-β mRNA上游引物：5′-GGACATCAACGGGTTCACTA-3′，下游引物：5′-GCCATGAGAAGCAGGAAAG-3′，内参GAPDH mRNA 上游引物：5'-CATGTTCCAATATGATTCCACC-3'，下游引物：5'- CCTGGAAGATGGTGATGG-3'，方法是按照实时定量RT-PCR试剂盒(日本Takara Bio公司)所规定的实验步骤进行，实验所得数据用ΔCT法来表示。

1.7 统计学分析

运用GraphPad Prism 6统计软件，用非参数检验方法进行分析。如果组间Kruskal-Wallis检验为有统计学差异，则用Mann-Whitney检验对数据进一步分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+ Treg细胞所占总CD4+ T细胞百分比

用流式细胞仪对该细胞在PBMCs的总CD4+T细胞中所占的百分比进行了检测(图1A、B)，发现CD4+Treg细胞在正常组(4.72±0.39)的比例显著高于AR组(2.52±0.26)，两组差异具有统计学意义(P<0.000 1)。见图1C。

2.2 IL-10和TGF-β在CD4+ Treg细胞培养基中的表达

IL-10和TGF-β是抑制性细胞因子，由CD4+Treg细胞产生和分泌，为了探讨CD4+Treg细胞的特点，我们对该细胞培养基上清液中IL-10 (96.19±6.96 vs 33.69±3.88)和TGF-β(77.73±7.96 vs 31.39±3.15)的浓度进行了检测，发现这两种细胞因子的浓度在正常组较AR组有所降低，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。见图2A、B。

图1 CD4+ Treg细胞的流式细胞仪检测 A：正常组；B：AR组；C：CD4+ Treg细胞所占总CD4+ T细胞百分比的比较。****P<0.000 1

图2 CD4+ Treg细胞培养基中IL-10和TGF-β浓度的比较 A：IL-10蛋白的比较；B：TGF-β蛋白的比较。****P<0.000 1

2.3 IL-10和TGF-β mRNA在CD4+ Treg细胞培养基中的表达

为了进一步探讨CD4+Treg细胞的活动状态，我们对该细胞培养基中两种细胞因子的mRNA进行了检测，以确定该Treg细胞合成抑制性细胞因子的情况。结果发现AR组IL-10和TGF-β mRNA含量(3.30±0.27 vs 0.26±0.05；3.29±0.26 vs 0.26±0.03)显著升高(P<0.000 1)。见图3A、B。

图3 CD4+ Treg细胞培养基中IL-10和TGF-β mRNA的比较 A：IL-10 mRNA的比较；B：TGF-β mRNA的比较。****P<0.000 1

2.4 II型细胞因子在PBMCs培养基中的表达

为了研究CD4+Treg细胞的功能，我们将体外培养的该细胞加入到AR患者来源的PBMCs培养基，并对其中的II型细胞因子IL-4和IL-5进行了检测。结果表明，AR组的IL-4(260.40±12.49)和IL-5(287.10±18.52)浓度较正常组(23.07±3.26；19.62±2.46)均显著升高(P<0.000 1)，当加入从正常组PBMCs中获取的CD4+Treg细胞时，两种细胞因子(241.70±12.44；262.40±18.88)的浓度均无明显下降，当加入从AR患者PBMCs中获取的CD4+Treg细胞时，两种细胞因子的浓度均显著下降(120.60±9.58；137.60±12.33)(P<0.000 1)，而且两组间进行比较，IL-4和IL-5浓度差异具有统计学意义，AR组CD4+Treg细胞降低它们浓度的程度更大((P<0.000 1)。见图4A、B。

图4 PBMCs培养基中IL-4和IL-5的比较 A：IL-4的比较；B：IL-5的比较。****P<0.000 1

3 讨论

CD4+Treg细胞可以调节Th1/Th2免疫平衡，并将Th2偏向的变应性炎症向Th1型炎症转化[10]。AR是Th2型炎症占主导地位的慢性疾病，其发病机制到目前并未确切阐明。以前的研究认为，AR发病的根本原因是由于Th1和Th2细胞之间的免疫平衡被打乱所致[11-12]。直到最近才发现，这种疾病的产生可能是由于Treg细胞和Th2细胞之间的平衡制约出现失调而导致[13]。

AR的治疗主要方法包括口服和局部用抗组胺药、糖皮质激素、减充血剂、肥大细胞稳定剂、白三烯受体拮抗剂、抗胆碱能药等，其主要目的是减少炎症介质和细胞因子的浓度，以缓解局部临床症状[14]。虽然上述药物可以减轻变应性炎症，但仍有一些不良反应存在，比如鼻内干燥、鼻出血、鼻中隔损伤，严重的还有肾上腺皮质功能不全[14]。而变应原免疫治疗(包括皮下注射和舌下含服)是到目前为止发现的、可能是唯一的一种针对病因的治疗方法，其机制主要包括降低炎症因子的浓度，上调封闭型抗体IgG4的含量，产生和释放抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的CD4+Treg细胞的增多[15-16]。但对CD4+Treg细胞在AR发病过程中的作用的研究至今还比较疏浅。

本研究将PBMCs作为干预对象，是因为PBMCs是由多种类型的免疫细胞组成的，包括固有类免疫细胞(比如单核细胞和树突状细胞)和获得性免疫细胞(包括T细胞和B细胞)，换句话说，就是PBMCs可以在一定程度上代表免疫系统的状态，正因为如此，该细胞群常用作对系统性免疫反应的研究[17]。因此我们将PBMCs作为干预研究的目标，对它的抑制也就是对免疫系统的抑制。

本研究旨在评估来自正常组和AR患者的CD4+Treg细胞的不同特点，并探讨该细胞对AR患者的抑制功能。CD4+Treg细胞从正常组和AR组志愿者的PBMCs中分离和提纯，结果发现，AR患者的总CD4+T细胞中CD4+Treg细胞所占百分比相比于正常人显著减少，这说明该调节性细胞可能通过细胞接触机制或其他方式对免疫平衡和耐受有调节能力。为了探讨CD4+Treg细胞的活动状态，我们对体外培养的该细胞培养基中细胞因子IL-10和TGF-β的浓度进行了检测，发现它们在变应性炎症状态下(即AR组患者)释放量显著升高，而在正常组反而减少。对蛋白的检测只能说明释放增加，对是否合成量上调，还需要对其mRNA进行评估，经过检测我们发现，也是来自AR患者的CD4+Treg细胞培养基中IL-10和TGF-β mRNA的含量显著增多，而正常人细胞培养基中其mRNA相对减少。这表明CD4+Treg细胞在炎症存在时处于激活状态，而在机体处于免疫平衡和耐受时并未激活。上述研究仅能从理论上说明CD4+Treg细胞可能有抑制炎症反应的可能性，还需要进行相关的干预实验，因此我们课题组又进行了干预研究。我们将从正常组和AR患者PBMCs中分离和提纯的CD4+Treg细胞加到AR患者来源的PBMCs的培养基中，意在评估调节性细胞的抑制功能。研究结果显示，AR组PBMCs培养基上清中IL-4和IL-5的浓度较正常组显著增高，说明符合变应性炎症的特点。当加入从正常组获得的Treg细胞后，这两种II型细胞因子的浓度未出现有统计学意义的改变，而当加入从AR组获取的CD4+Treg细胞后，IL-4和IL-5在PBMCs培养基中的浓度显著下降。这证实了CD4+Treg细胞对免疫系统细胞的负向调节功能，也证实了在变应性炎症环境下，该类型细胞处于活跃状态，也只有在其处于此种激活状态时才能充分履行抑制炎症反应的功能。当然AR组和正常组干预结果之间的差异具有统计学意义，即前者的降低II型细胞因子IL-4和IL-5浓度较后者更显著。这也从侧面说明，CD4+Treg细胞在人体处于正常的免疫平衡时可能不是通过分泌抑制性细胞因子来调节和制约免疫系统的，可能通过细胞-细胞接触的方式，至于其机制，还有进一步研究和探讨。

本课题的主要局限性在于样本数比较少，没有对鼻黏膜局部的CD4+Treg细胞的特点进行研究，而且我们只着眼于分子层面，没有涉及到相关的基因改变，我们将在以后的研究中进一步探讨。

总之，本研究证明，CD4+Treg细胞在变应性炎症状态时，其占CD4+T细胞的比例相对于正常状态下减少，但其在炎症刺激下可以发挥抑制炎症反应的功能。因此，当我们对CD4+Treg细胞疗法进行开发，并考虑将来临床上对AR进行治疗时，需要用适当的手段先对该细胞进行刺激，使其进入激活状态，才能达到有效治疗AR的目的。