响应面法优化蓝莓白藜芦醇的提取工艺

姜宏宇，仇宏图，曲可欣，马明月，陈巍元，张华

1.延边大学农学院食品与生物科学系（延吉 133002）；2.延边大学东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心（延吉 133002）

蓝莓（blueberry），又名越橘、蓝浆果，果实为近圆形、呈蓝色的小浆果。蓝莓果实中营养物质含量丰富，除了含有常见的糖、蛋白质、矿物质、维生素等一般性营养成分外，还含有白藜芦醇、多酚等具有生理功能的化学成分[1]。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种具有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，一般认为是植物在遭受恶劣环境所产生的防御物质[2]。有研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、保护心血管、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[3-4]。

目前，国内外白藜芦醇大多都从葡萄、虎杖等植物中提取，王慧竹等[5]优化了虎杖茎中白藜芦醇提取工艺，得到最佳提取条件，即60%的乙醇在80 ℃下，按料液比1∶15 g/mL，提取2 h。该方法不仅溶剂用量大，耗时长，而且提取率不高，杂质多。常永芳等[6]选用80%乙醇和80%丙酮的混合液为提取剂，得到虎杖中白藜芦醇的最佳提取条件为V（80%乙醇）∶V（80%丙酮）=1∶3为提取液、料液比1∶6 g/mL、在70 ℃下超声5 min，此时白藜芦醇的提取率为2.612%。潘润天等[7]优化了花生红衣中白藜芦醇提取工艺，最佳工艺条件为取液料比值为15 mL/g，制提取时间为64 min，提取温度为50 ℃，白藜芦醇的含量为18.1785 μg/g。

而在蓝莓中提取白藜芦醇的有关研究较少。同时，国内外蓝莓中活性物质的提取方法广泛采用有机溶剂萃取法[8]，但仅靠溶剂浸提的方法，提取率并不高，添加果胶酶和纤维素酶，不仅加速植物体细胞壁的软化，还有使其膨胀及崩溃的作用，促进活性物质的溶出，从而提高得率。因此，试验以蓝莓为原料，采用复合酶辅助溶剂提取法有效提高蓝莓中白藜芦醇的提取量，在单因素试验的基础上，筛选出影响含量的关键因素，再通过响应面法优化提取工艺参数，以期为优化蓝莓中白藜芦醇的提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山地区新鲜蓝莓；白藜芦醇标准品、纤维素酶、果胶酶，均购置阿拉丁试剂有限公司；甲醇、乙醇、氯化钾、醋酸钠、无水碳酸钠等试剂均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TDZ5-MS型低速多管架自动平衡离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SPF-110X12型往复式恒温震荡水浴培养摇床，上海世平实验设备有限公司；FD-1C-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DCY-SY12型恒温水浴氮吹仪，浙江硕丹科技有限公司；JA1003J型分析天平，上海雷韵试验仪器制造有限公司；101-3型电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 蓝莓粉的制备

新鲜蓝莓榨汁后将蓝莓果皮在冷冻干燥盘中均匀薄层铺开封膜，放进-80 ℃冰箱内冷冻24 h拿出放入冷冻干燥机中，冷冻48 h取出刮粉得到初制样品，将样品放置研钵中磨碎（过孔径0.150 mm筛）得样品备用。

1.4 样品溶液的制备

精密称定蓝莓果皮粉末0.5 g，按料液比1∶20 g/mL添加质量分数为95%的乙醇溶液，调节酶解温度和酶解pH，添加适量纤维素酶与果胶酶共1.5 mg，恒温摇床一段时间，转速为4 000 r/min，分离出上清液。

1.5 样品中白藜芦醇含量的测定

参照师守国等[9]的方法，取50 μL待测样品，采用与白藜芦醇标准品测定相同方法测定吸光度。白藜芦醇标准曲线的建立：称取白藜芦醇标准品5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇作为溶剂进行定容。分别吸取溶液0，50，100，150，200，250和300 μL各置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到质量浓度分别为0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 μg/mL的对照品溶液，以甲醇作为空白，分别测定在305 nm波长下的吸光度，以标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.6 单因素试验

1.6.1 复合酶比例的确定

取7份0.5 g蓝莓粉末样品，选择酶解温度为50 ℃、酶解pH为5，酶解3 h，分按表1添加复合酶（同时使用单一纤维素酶和果胶酶作为对照），酶解反应结束后，测定白藜芦醇的含量。

1.6.2 酶解温度的确定

取5份0.5 g蓝莓粉样品，选择酶解pH为5、选择上一组酶解最佳比例、酶解时间为3 h，控制酶解温度分别为40，45，50，55和60 ℃，提取后测定白藜芦醇的含量。

表1 复合酶比例对含量的影响 单位：g

1.6.3 酶解时间的确定

取5份0.5 g蓝莓粉样品，选择上一组酶解最佳温度、酶解最佳比例、酶解pH为5.0，控制酶解时间分别为1，2，3，4和5 h，提取后测定白藜芦醇的含量。

1.6.4 酶解pH的确定

取5份0.5 g蓝莓粉样品，选择上一组酶解最佳时间、酶解最佳温度以及酶解最佳比例，控制酶解pH分别为3，4，5，6和7，提取后测定白藜芦醇的含量。

1.7 响应面优化试验设计

采用Box-Behnken试验设计，在单因素试验的基础上，以白藜芦醇的含量为响应值，通过响应面分析法进行三因素三水平的试验设计。最后应用Design-Expert对试验结果进行构图分析，并对最优值进行预估。

表2 因素水平表

1.8 数据统计和分析

使用统计分析软件SPSS 24.0对试验数据进行单因素方差分析，检验各组数据的显著性，显著性水平选择0.05，最后采用Design-Expert 8.0分析软件进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 复合酶用量的确定

由图1可知，复合酶的效果要比单一酶好。在使用复合酶的样品中，白藜芦醇的含量总体上呈现上升的趋势。随着果胶酶比例的增加，细胞间的果胶质分解速度加快，白藜芦醇苷释放得更多，含量逐步增加，在复合酶中，果胶酶起到主要作用。当纤维素酶：果胶酶比例为1∶5时，白藜芦醇含量达到最大，为363.74 mg/L。综合考虑显著性差异，选取m（纤维素酶）∶m（果胶酶）5∶1，1∶1，1∶5 3个水平进行响应面设计。

2.2 酶解温度的确定

如图2可知，随着温度升高，白藜芦醇的含量总体呈现先上升后下降的趋势。在50 ℃达到最大值，白藜芦醇含量为332.01 mg/L；当温度超过50 ℃时，白藜芦醇的含量开始下降。这是因为适宜的温度下，酶的活性随着温度的上升而提高，细胞分解速度不断提高，白藜芦醇苷释放速度加快，含量不断提高；而温度过高（＞50 ℃时），一方面酶在高温下部分失活，活性受到抑制，另一方面白藜芦醇在高温下易分解，导致含量降低。综合考虑，选取45，50和55 ℃ 3个水平进行响应面设计。

图1 不同复合酶比例对白藜芦醇含量的影响

图2 不同酶解温度对白藜芦醇含量的影响

2.3 酶解pH的确定

如图3可知，随着pH的增加，白藜芦醇的含量总体上呈现先上升后下降的趋势。pH在3到6时，随着pH增大，白藜芦醇的含量呈现上升趋势；当pH等于6时，白藜芦醇的含量达到最大值，为318.77 mg/L；当pH＞6后，白藜芦醇的含量呈现下降趋势。pH对白藜芦醇含量的影响主要原因在于pH对酶的影响。pH在3～6范围内时，酶的活性随着pH增大而增强，细胞壁分解加快，白藜芦醇含量逐渐上升；pH在6～7范围内，酶的活性受到抑制，细胞壁分解速度减慢，含量开始下降。综合考虑，所以酶解pH选择5，6，7 3个水平进行响应面设计。

2.4 酶解时间的确定

如图4所知，当酶解1 h后，白藜芦醇含量趋于最大值，为314.20 mg/L。当酶解2 h时，白藜芦醇得率趋于下降，在3 h后白藜芦醇含量再次上升。酶解4 h后，白藜芦醇含量趋于平缓后开始下降。这可能是由于反应开始时，底物浓度大，复合酶可快速水解底物，白藜芦醇含量随着酶解时间的增加而快速提高，从而达到相对最佳提取条件。在2 h时，可能由于部分酶由于酶解环境突然变化而使得酶解反应缓慢，而容器内氧气氧化白藜芦醇，导致白藜芦醇含量下降。在3 h时，可能酶解完全，所以在此处上升。在4～5 h，白藜芦醇含量变化可能主要受到容器内氧气的影响，且随着容器内氧气消耗，下降速度减缓，最终白藜芦醇含量将趋于稳定。为了节省时间，又因为酶解时间是相对影响因素最小的条件，故酶解时间选择1 h。

图3 不同酶解pH对白藜芦醇含量的影响

图4 不同酶解时间对白藜芦醇含量的影响

2.5 响应面法优化蓝莓白藜芦醇提取工艺

2.5.1 响应面试验设计与结果

通过单因素试验，根据Box-Behnken设计原理，以复合酶比例、酶解温度、酶解pH 3个因子为自变量，分别用A、B、C表示，以白藜芦醇的含量为响应值设计了3个因素、3个水平共17个试验点的响应面分析试验，以随机次序进行，重复3次获得的响应值均值，响应面试验设计与结果见表3。

2.5.2 数据模型建立与回归分析

利用Design-Expert 8.0软件对表3试验数据进行二次多项式回归拟合，得到白藜芦醇含量对复合酶比例（A）、酶解温度（B）、酶解pH（C）的回归模型方程Y（mg/L）=342.06+23.12A+7.71B+2.40C+5.99AB+0.51AC+0.86BC+11.90A2-20.29B2-13.44C2，Y为白藜芦醇含量的预测值。一次项系数值的大小可以反映因素对响应值的影响程度，由回归方程可得出提取蓝莓中白藜芦醇的主次影响因素顺序为复合酶比例＞酶解温度＞酶解pH。

表3 响应面试验设计与结果

2.5.3 回归模型的方差分析

从表4方差分析可以看出，该模型的p＜0.001 8＜ 0.01，表现为极显著。失拟项的p=0.088 4＞0.05，表明无失拟因素存在，各因素的效应关系为复合酶比例＞酶解温度＞酶解pH。其校正决定系数R2（adj）=0.860 8＞0.80和变异系数（CV）为2.59%，说明此模型拟合度好，误差小，可以用来分析和预测白藜芦醇的含量。

表4 回归模型方差分析

2.5.4 响应面分析

各因素的相互关系以及相互作用程度，可以通过响应面图反映[10]。通过观察响应面的变化情况和等高线的稀疏程度，可以更加直观、清晰地观察两因素之间关系，当等高线呈圆形且坡度较平缓时，表示两因素交互作用不显著，呈椭圆形且坡度较陡时，表示两因素交互作用影响显著[11]。

从3D响应面图（图5～图7）可以看出，各个因素对白藜芦醇提取率的影响程度。由图5可知，酶比例曲面的变化程度比酶解温度曲面变化更大，说明酶比例对白藜芦醇提取率的影响更显著；由图7可知，酶解温度曲面变化程度比pH曲面变化程度大，说明酶解温度对提取率的影响较显著，以上均与方差分析相符。图7等高线为椭圆形状，说明酶解温度和pH之间交互作用显著。

图5 酶比例和酶解温度交互作用

图6 酶比例和pH的交互作用

图7 酶解温度与pH的交互作用

2.5.5 提取条件的优化及验证试验

通过软件回归方程对进一步优化，由以上结果分析得出最佳提取工艺条件为m（纤维素酶）∶m（果胶酶）=0.99∶1，酶解反应温度为54.69 ℃，酶解pH为5.45，酶解时间为1 h，提取白藜芦醇质量浓度为372.76 mg/L。同时结合实际条件，最佳工艺选取m（纤维素酶）∶m（果胶酶）=1∶1，酶解反应温度为55 ℃，酶解pH为5.5，酶解时间为1 h，在此条件下白藜芦醇含量为371.79 mg/L，与预测值的相对误差为0.26%。采用响应面法优化蓝莓中白藜芦醇提取工艺条件是合理可行的。

3 结论

在单因素试验的基础上，采用响应面法优化蓝莓中白藜芦醇的提取工艺条件，得出最佳提取工艺条件：m（纤维素酶）∶m（果胶酶）=1∶1，酶解反应温度为55 ℃，酶解pH为5.5，酶解时间为1 h，在此条件下白藜芦醇含量为371.79 mg/L。