一种简便的骨动态参数计量方法*

彭松林 王尚 王振民 龙灿玲 唐菀泽 贺小琴 陈高扬

骨形态计量学是骨科研究中常用的研究骨代谢的手段，但骨组织结构致密且富含钙盐和无机盐导致其脆性增加，普通切片很难切除完整骨组织[1]。目前常用的骨组织切片需进行脱钙处理，而普通脱钙液普遍需要3～4 周，甚至几个月的脱钙时间，耗时长且对组织形态有着不可逆转的损伤[2-3]。由于骨组织的特殊性，导致计算其动态学参数时需要借助硬组织切片机，并且为了保证切出完整的条带，借助塑料包埋技术在骨组织中的切片的方法应运而生[4-5]。目前常规的骨组织切片需要Leica SP1600 锯式切片机和SP2600 切片机并配合钨钢刀片使用，同时还得借助特殊的膜用来黏附骨组织[6]，导致实验成本巨大，限制了大部分科研团队的研究进展[7]。本研究通过普通冰冻切片机和透明胶带黏附骨组织的方法，观察其荧光条带变化和骨组织形态完整性，旨在探索简化的不脱钙硬组织切片技术。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

4%中性多聚甲醛固定液[生工生物工程（上海）股份有限公司]；钙黄绿素（Sigma 公司，美国）；819 一次性刀片（莱卡，德国）；Cryofilmtype3C 黏附膜（SECTION-LAB，日本）碳酸氢钠[生工生物工程（上海）股份有限公司]；文具透明胶带（铠圳，深圳）；OCT 冷冻切片包埋剂（樱花，美国）；医用生理盐水；蔗糖（麦克林，上海）。其中，钙黄绿素需要用含2%的碳酸氢钠生理盐水配制成5‰浓度溶解后避光保存现配现用，按照每只动物25 mg/kg 腹腔注射。

Leica CM1860 冰冻切片机（莱卡，德国），Leica Dmi8倒置荧光显微镜（莱卡，德国），ZH-GSZ 高速颅骨钻（安徽正华生物仪器设备有限公司），SkyScan 1076 micro-CT 扫描仪（布鲁克，比利时）。

1.2 动物处理

12 只两月龄SD 雌性大鼠购自广东省实验动物中心，所有动物实验均事先经过医院伦理委员会审批并严格按照SPF级实验要求操作。将12 只大鼠随机分成假手术组（sham）和双侧卵巢切除组（OVX）后，进行卵巢切除实验，并继续饲养2 个月后于取材前第9 天和第2 天按照体重注射对应剂量钙黄绿素[8]。取材时去除干净股骨附着物，并于固定液中固定24 h。对股骨进行micro-CT 扫描，判断骨质疏松模型是否成功。扫描完股骨后蔗糖梯度脱水，进行后续硬组织切片并计量骨形态动态参数。

1.3 实验方法

进行microCT 扫描后，将股骨放入20%蔗糖溶液过夜。待骨组织沉底后再换成30%蔗糖溶液脱水1 d，然后用高速颅骨转切开股骨头两端，分别将股骨干部分和股骨头采用樱花OCT 包埋，并提前将冰冻切片机降温至-25℃。待样本完全冰冻后将包埋好的样本转移至样品槽中，并调整位置使股骨长轴与刀片平行，旋紧固定螺丝将样本固定，防止在切片过程中松动。先采用20 m 修片，待到切片完整后调成6 m 并调整刀片位置，保证切片时刀片完好没有豁口。将办公用透明胶带黏附于样本上，用预冷镊子轻轻刮下样本表面使两者接触充分（见图1A）同时将表面涂有合成橡胶的Cryofilmtype3C 黏附膜黏附于样本上作为对比（见图1B）。用刀片无划痕一端匀速切片，同时用冰冻切片毛笔轻提透明胶带/黏附膜，直至切片完全脱离，用镊子将透明胶带/黏附膜提起置于载玻片上并做好标记，肉眼可见两组膜黏附下来的股骨头组织形态完整，结构清晰（见图2），同时荧光显微镜下观察切片效果。并采用HE 染色观察股骨头里组织形态变化，同时观察股骨头中荧光形态。

图1 透明胶带/黏附膜在切片过程中与组织的具体应用：A.透明胶带；B.黏附膜

图2 切片大体轮廓显示透明胶和黏附膜组均能很好地切出完整股骨头形态

2 结果

按照此法对股骨干进行不脱钙冰冻切片，切片厚度均为6 m，组织结构完整。钙黄绿素标记的骨组织在荧光显微镜下能观察到明显的荧光条带。microCT 结果显示卵巢切除组大鼠骨量相对于假手术组明显下降（见图3），同时大鼠静态骨形成参数显示与假手术组相比，卵巢切除组骨量、骨小梁厚度、骨小梁数量以及骨小梁间距显著降低（见图4）。硬组织切片荧光结果显示，卵巢切除组大鼠和假手术组相比两条荧光条带间间隙明显狭窄很多（见图5），钙黄绿素荧光标记结果与microCT 结果一致；大鼠动态骨形成参数显示：骨矿沉积率、相对骨形成率显著减少（见图6）。同时股骨头切片外观大体完整（见图2），荧光下可见深浅不一的代表钙盐沉积的绿色荧光同时HE染色结果显示切片结构大体完整，骨小梁结构清晰（见图7）。因受冰冻切片的条件所限，组织形态不如石蜡切片致密美观。但冰冻切片结果不影响实验观察，可作为快速检测计量骨组织的简便方法。

图3 股骨MicroCT分析：A.假手术组和卵巢切除组股骨远端代表性MicroCT 图像；B.骨小梁结构3D 重建模型

图4 静态骨形成参数：A.骨表型参数；B.骨组织形成率；C.骨小梁厚度；D.骨小梁数量

图5 不同膜在sham 组和ovx 组新骨形成过程中绿色荧光条带宽度

图6 大鼠动态骨形成参数：A.骨矿化沉积率；B.相对骨形成率

图7 硬组织切片股骨头荧光图和HE 染色结果（×100）

3 讨论

人的骨骼通过成骨细胞和破骨细胞不断重建，它们的有序供给对骨骼内环境的稳定有着重要作用。骨重建包括骨吸收及其耦联的骨形成两方面，在正常情况下，成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收维持动态平衡[9]。多个信号通路在骨重建过程中起到重要的作用，已有研究发现在骨折愈合早期，抑制EGFR 信号通路能抑制骨内、外膜来源SCs 的增殖，促进其成骨、成软骨的分化[10]。骨组织形态计量学是近年来兴起的关于骨动态学参数的计算，通过特殊的钙标记物（钙黄绿素）用来评价骨动态形成过程[11]。运用荧光标记和透射光图像融合的特征从而得出骨重建的效果[12]。钙黄绿素荧光标记动物已成为骨动态学参数的重要一环[13]，但因荧光染料的特殊性，常规的石蜡脱钙切片会对荧光造成干扰。目前，国内外通用的方法是采用硬组织冰冻切片法来研究骨动态学[14-16]。因为冰冻切片的特殊性，很多黏附膜不能在低温下黏附组织，因此Aaron 等[17]提出了一项新鲜骨组织切片制备技术，他们使用一种压力敏感黏合剂黏附骨组织，并在表面涂覆高分子聚合物，以保证获得完整组织切片。该技术极大地提高了骨组织计量学的发展，使得后续的科研工作者们能通过钙黄绿素荧光标记得出骨重建的效果。然而硬组织切片对仪器要求较高（要求特殊的进口钨钢刀片）并且需要特殊的黏附薄膜，极大阻碍了科研进程。

经过摸索笔者发现利用普通的冰冻切片机（Leica CM1860）配合透明胶带也能达到良好的荧光效果，对骨动态学参数的计算无任何影响。这极大地简化了不脱钙骨切片的方法并能得到良好的实验结果。本研究使用高黏附性黏附膜和透明胶带黏附组织作对比，发现透明胶带也能成功切出完整条带并且2 条荧光条带非常清晰明显。提示我们简便的硬组织不脱钙切片方法行之有效，并且成本低廉，操作方便，适合大部分科研单位使用。冰冻切片对刀片要求较高，为了保证切片的完整性，尽量换新的刀片，在切片过程中需要保证透明胶带和组织贴合好，这样才能得到完整的切片结果。并且尽量边切片边在荧光显微镜下观察，从而得到完美的实验结果。