狼疮性肾炎患者血清微小RNA-146a和微小RNA-155水平及其预测病情活动的效能▲

冯颖博 叶 倩 罗雄燕

(1 四川省巴中市中心医院肾脏内科，巴中市 636000，电子邮箱：liwanyu9862@163.com；2 四川省巴中市中医院消化内科，巴中市 636000；3 四川大学华西医院风湿免疫科，成都市 610041)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)可累及肾脏，常可引发狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)，即免疫复合性肾炎，而LN又可增加SLE患者病死率[1]。SLE的主要特征为自身抗体产生、免疫复合物形成，研究显示B淋巴细胞异常增殖及分化可促进SLE的发生及发展，而SLE病情的快速进展常可导致肾脏损伤进而引发LN[2]。目前，临床上采用的抗双链DNA(double-stranded DNA,ds-DNA)抗体、免疫复合物及补体等生物标志物辅助诊断LN，但其灵敏度及特异度较低，且不能有效预测LN患者疾病的活动性，因此寻找新型生物学标志物用于评估LN患者的疾病进展，对临床诊断及治疗具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)广泛分布于肿瘤组织、外周血单核细胞及血清中，是一类具有潜在应用价值的标志物，研究证实SLE患者外周血单核细胞中部分miRNA表达水平异常[3]。相关研究表明，miRNA-155参与机体固有及获得性免疫反应，可调节T淋巴细胞、B淋巴细胞等细胞的分化并调控其功能，进而参与免疫性疾病的发生及发展[4]；而miRNA-146a异常表达与局部或系统性炎症及自身免疫性疾病的发生及发展密切相关，调控miRNA-146a表达可有效治疗多种炎症性疾病[5]。因此，本研究分析LN患者血清miRNA-146a、miRNA-155表达水平及其与LN疾病活动性的相关性，评估两者预测LN病情活动的效能。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年10月至2018年6月巴中市中心医院收治的122例LN患者为研究对象，所有患者均符合系统性红斑狼疮国际合作组制定的SLE诊断标准[6]。根据SLE疾病活动度指数(SLE disease activity index，SLEDAI)[7]将LN患者分为LN活动组(SLEDAI评分≥10分，65例)与LN稳定组(SLEDAI评分<10分，57例)。另选同期于本院体检的48例健康志愿者为对照组。纳入标准。(1)所有LN患者均经肾穿刺病理检查确诊；(2)未患有其他免疫性疾病；(3)对本研究知情且签署同意书。排除标准：(1)原发性或其他继发性肾脏疾病患者；(2)合并恶性肿瘤或严重心血管疾病患者；(3)近期患有感染病患者；(4)近期或既往接受糖皮质激素或细胞毒类药物治疗患者；(5)精神疾病患者。LN活动组女性54例，男性11例，年龄30～45(37.69±6.28)岁；LN稳定组女性41例，男性16例，年龄30～47(38.47±6.41)岁；对照组男性12例，女性36例，年龄32～50(39.12±6.52)岁。3组研究对象性别、年龄差异无统计学意义(均P>0.05)。具有可比性。本研究已通过巴中市中心医院医学伦理委员会审核。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂及仪器：TRIzol试剂、RNA反转录试剂盒均购自赛默飞世尔科技有限公司(批号：15596026、K1622)；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自北京优尼康生物科技有限公司(批号：4367659)；抗ds-DNA抗体酶联免疫吸附测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(批号：ml025867)。ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；引物由上海生工有限公司合成；SYSMEX XE-2100全自动血液分析仪购自希森美康医用电子有限公司；HITACHI 7600-210自动生化分析仪购自杭州瑞析科技有限公司；Access 2全自动免疫分析仪购自贝克曼库尔特公司。

1.2.2 血清miRNA-146a、miRNA-155表达水平的检测：采集研究对象空腹静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min，吸取上清置于-80℃冰箱保存备用。采用TRIzol法提取样本总RNA，应用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，采用Agilent 2100生物分析仪鉴定总RNA质量；将1.5 μg RNA反转录为cDNA，参照实时荧光定量PCR试剂盒说明书检测miRNA-146a、miRNA-155相对表达量。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL，包括SYBR Green qPCR Mix(2×)10 μL、cDNA 2 μL、正反向引物各1 μL、ddH2O 6 μL，以U6为内参，miRNA-146a、miRNA-155及U6的引物序列见表1。反应条件为95℃ 15 min、95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环。反应结束后收集荧光，采用2-ΔΔCt相对定量法计算miRNA-146a、miRNA-155的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.3 实验室指标的检测：按照1.2.2方法采集血标本，应用SYSMEX XE-2100全自动血液分析仪检测红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)；采用自动生化分析仪检测血清肌酐；采用免疫比浊法检测补体C3、C4，仪器为IMMAGE 800型全自动特定蛋白分析仪(美国贝克曼公司)，并采用配套试剂盒检测(批号：1709-2)；采用免疫印迹法检测抗ds-DNA抗体滴度，仪器为全自动免疫分析仪；采用酶联免疫吸附测定法检测抗C1q抗体含量，仪器为MK3型酶标仪(芬兰雷柏公司)，并采用配套试剂盒检测(批号：17031)。计算估测肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)，eGFR=186×血清肌酐-1.154×年龄-0.203×0.742(女性)。收集LN患者24 h尿液，记录体积并分别留取10 mL用于24 h尿蛋白含量检测。

1.2.4 相关评分：采用Austin评分系统评估LN患者肾组织活动性指数和慢性指数、肾小管间质病变评分[8]。SLEDAI共21项指标，对SLE患者过去10 d内癫痫发作、精神症状、视觉受损等疾病活动状况进行评估，总分99分，<4分为基本无活动，5～9分为轻度活动，10～14为中度活动，≥15分为重度活动。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验,两组间比较采用t检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析法；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析血清miRNA-146a、miRNA-155水平对LN患者疾病活动程度的预测价值。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组常规实验室指标的比较 3组血清肌酐、ESR、C3、C4及eGFR水平差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中对照组、LN稳定组、LN活动组血清肌酐、ESR水平依次升高，C3、C4水平依次降低；其他两组eGFR水平均低于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 3组一般资料及常规实验室指标的比较

2.2 3组血清miRNA-146a、miRNA-155相对表达水平的比较 对照组、LN稳定组、LN活动组血清miRNA-146a、miRNA-155相对表达水平依次降低(P<0.05)，见表3。

表3 3组血清miRNA-146a和miRNA-155相对表达水平的比较(x±s)

2.3 LN活动组与稳定组患者疾病活动性指标的比较 LN活动组患者抗ds-DNA抗体、抗C1q抗体水平及SLEDAI、慢性指数、活动性指数、肾小管间质病变评分均高于LN稳定组(P<0.05)，见表4。

表4 LN活动组与稳定组患者疾病活动性指标的比较(x±s)

2.4 LN患者血清miRNA-146a和miRNA-155表达水平与疾病活动性指标的相关性 LN患者血清miRNA-146a、miRNA-155相对表达水平均与ESR、抗ds-DNA抗体、抗C1q抗体水平、SLEDAI呈负相关，而均与C3水平呈正相关(均P<0.05)，见表5。

表5 LN患者血清miRNA-146a和miRNA-155表达水平与疾病活动性指标的相关性

2.5 血清miRNA-146a和miRNA-155表达水平对LN病情活动的预测价值 miRNA-146a截断值为0.57时，预测LN患者病情活动的敏感度为83.08%、特异度为91.23%；miRNA-155截断值为0.42时，预测LN病情活动的敏感度为84.62%、特异度为89.47%。见图1、表6。

图1 血清miRNA-146a和miRNA-155预测LN患者病情活动的ROC曲线

表6 血清miRNA-146a、miRNA-155表达水平预测LN患者病情活动的效能

3 讨 论

LN具有易复发、病情迁延、并发症多、患者预后差等特点，随着病情进展最终可发展为终末期肾病，而病情活动程度是影响疾病进展及预后的主要因素之一[9]。目前临床上主要依靠肾活检评估LN病理损伤程度，但有创性和不可重复性等特点使肾活检的应用受限；而抗ds-DNA抗体、补体C3等临床指标判断LN病情程度均存在一定局限性[10]。有研究表明，LN的发生与发展过程涉及T淋巴细胞、白细胞介素18等多种炎性细胞或细胞因子[11]。寻找既可反映LN临床活动性又可反映LN病理活动性的血清学指标，对于评估LN病情活动程度具有重要意义。

研究表明，miRNA-146a在心肌细胞与巨噬细胞中呈高表达，miRNA-146a过表达后又可抑制核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信号通路及相关炎性因子的产生[12]。Mann等[13]研究发现，经脂多糖刺激后单核细胞中miRNA-146a表达水平上调，进而抑制炎症介质的释放；而炎症因子又可通过Toll样受体信号通路促使miRNA-146a表达水平上调，以抑制下游基因表达，从而发挥负向调节炎症反应的作用。还有研究显示，SLE患者血清miRNA-146a表达水平低于正常健康受试者，而强直性脊柱炎患者血清miRNA-146a表达水平也显著升高[14-15]。miRNA-155在多种免疫细胞中均呈高表达，研究显示变应性鼻炎患者血清miRNA-155表达水平升高，其可能参与疾病发生过程[16]。miRNA-155还可抑制Toll样受体信号通路中NF-κB的表达，进而负向调控脂多糖诱导的炎性介质表达[17]。也有研究显示，SLE患者血清miRNA-155表达水平显著降低，并可作为临床诊断SLE的重要标志物[18]。以上研究均表明miRNA-146a和miRNA-155与炎症反应性疾病均有关，而Huang等[19]研究发现，miRNA-146a与miRNA-155表达水平异常可反映肾脏疾病严重程度，并可通过NF-κB等通路影响疾病的进展。本研究结果显示对照组、LN稳定组、LN活动组血清miRNA-146a、miRNA-155相对表达水平依次降低(P<0.05)，提示miRNA-146a、miRNA-155可能参与LN发生与发展的过程。

抗ds-DNA抗体水平升高、补体C3水平含量下降可反映LN患者肾脏受损程度及疾病活动程度[20]。有临床研究显示，SLE患者抗C1q抗体与SLEDAI、C3和C4水平具有良好相关性，是一种较为敏感且特异的自身抗体，对评估疾病活动程度具有重要意义[21-22]。本研究结果显示，LN患者血清miRNA-146a、miRNA-155表达水平与ESR、抗ds-DNA抗体、抗C1q抗体水平及SLEDAI评分呈负相关，与补体C3水平呈正相关(P<0.05)，进一步提示血清miRNA-146a、miRNA-155表达水平与LN活动情况有关。而ROC曲线分析结果显示，miRNA-146a与miRNA-155预测LN病情活动的敏感度及特异度均较高，提示血清两者对LN患者的疾病进展情况具有较高的预测价值，或可作为临床评估LN病情活动性的辅助标志物。

综上所述，LN患者血清miRNA-146a与miRNA-155表达水平降低，两者预测LN病情活动的效能均较高，或可成为评估LN疾病活动性的重要标志物。