CD8、CD68、FoxP3、PD1和PD-L1在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

李海军，边 沁，何先伟

四川省广元市中心医院检验科，四川广元 628000

子宫内膜癌为原发于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，具有发病因素多、机制尚不明确的特点，有研究报道其病死率已居恶性肿瘤的前10位[1]。近年一些学者探讨了子宫内膜癌前病变与子宫内膜癌的关系，发现细胞免疫水平与疾病密切相关，考虑通过评估T淋巴细胞及肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)相关分子标志物的表达水平来防治子宫内膜癌前病变的恶性发展[2-3]。TILs参与肿瘤微环境组成和局部免疫应答，既往研究已证实TILs表达水平影响癌症化疗效果，考虑与相关标记抗体对临床指标的影响有关[4]。肿瘤细胞浸润后T淋巴细胞活化程度增加，程序性死亡因子1(PD1)表达上调，与程序性死亡配体1(PD-L1)相互作用后诱导T淋巴细胞凋亡，进而下调机体抗肿瘤免疫应答。另外，近年以PD-L1为靶点的治疗药物已在乳腺癌患者中得到应用[5]。但目前关于TILs标记抗体CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1与子宫内膜癌发生和发展关系的报道较少，且尚缺乏临床数据支持。因此，本研究就此展开讨论，明确子宫内膜癌前病变恶性发展的预测因子，以期为子宫内膜癌防治提供新的预测依据和治疗靶点，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年1月至2018年12月本院96例子宫内膜癌患者纳入子宫内膜癌组，68例子宫内膜正常女性纳入正常子宫内膜组。子宫内膜癌患者年龄26～60岁，平均(42.25±4.14)岁，<49岁38例，≥49岁58例；病理学分级G1～G2级45例，G3级51例；国际抗癌联盟分期Ⅰ期42例，Ⅱ～Ⅲ期54例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移74例；正常子宫内膜来源女性年龄28～56岁，平均(41.85±4.08)岁，<49岁42例，≥49岁26例。子宫内膜癌组与正常子宫内膜组年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。入选标准：(1)经病理学检查确诊；(2)子宫发育正常的女性；(3)年龄18～65岁；(4)入院前均未接受放疗、化疗或靶向治疗；(5)未发生全身其他部位转移；(6)卡氏( KPS)评分≥70分；(7)预计生存期超过1年。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)依从性差，不能定期随访；(3)有乳腺癌既往史；(4)过敏体质或凝血功能异常；(5)沟通障碍或严重精神疾病；(6)临床资料不完整，相关检查不完善；(7)未完成治疗；(8)因疾病恶化或出现严重并发症需进行其他治疗。本研究经本院医学伦理委员会讨论并通过，患者及家属均签署知情同意书。

1.2方法 采用RM2235组织切片机(德国徕卡)将所有包蜡组织切成4 μm连续切片，依次采用二甲苯(南通新能源物资有限公司)、枸橼酸钠缓冲液(北京泰泽瑞达科技有限公司)及3%过氧化氢溶液(北京百欧博伟生物技术有限公司)进行脱蜡、抗原修复、梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液(PBS)(上海颖心实验室设备有限公司)漂洗，内源性过氧化物酶活性消除；滴加小鼠抗人PD1、PD-L1、CD8、CD68、FoxP3多克隆抗体(浓度1∶100，购自美国Santa Cruz公司)4 ℃孵育过夜；PBS漂洗，滴加即用型生物素化二抗37 ℃孵育30 min；PBS漂洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS漂洗，经DAB显色试剂盒(Solarlaio)显色，苏木精(湖南汇百侍生物科技有限公司)复染，梯度乙醇脱水，透明，中性树脂(南京森贝伽生物科技有限公司)封片，DMM-440倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)下观察CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1表达。

1.3染色判定标准 由两名具有执业资格的病理科医生采用双盲法对结果进行判断和分析：每张切片中选取癌细胞数较多的5个高倍视野(SP，×400)，每个视野计数100个细胞；染色强度：0分为不着色，1分为淡黄色，2分为深黄色，3分为棕黄色；阳性细胞百分率：1分为阳性细胞百分率0～30%，2分为阳性细胞百分率>30%；两项之和进行综合判定：PD1、PD-L1表达量0～1分判定为-，2～6分判定为+[6]；CD8、CD68、FoxP3表达量≤3分判定为-，>3分判定为+[7]。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，组间有序分类资料比较采用Ridit分析；采用Kendall′s tau-b法对等级资料进行相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CD8、CD68、FoxP3在TILs细胞上的表达情况 CD8、CD68主要定位于TILs细胞膜上，FoxP3主要定位于TILs细胞核上，为棕黄色颗粒，CD8、CD68、FoxP3在正常子宫内膜组织中呈强阳性表达，见图1。子宫内膜癌组织中CD8、CD68、FoxP3阳性率分别为33.33%(32/96)、36.46%(35/96)、37.50%(36/96)，明显低于正常子宫内膜组织中CD8、CD68、FoxP3阳性率[64.71%(44/68)、70.59%(48/68)、67.65%(46/68)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2PD1、PD-L1在TILs及T淋巴细胞上的表达情况 PD1、PD-L1主要定位于细胞膜或(和)细胞质上，为棕黄色颗粒；PD1、PD-L1在子宫内膜癌组织中TILs及T淋巴细胞上均呈阳性表达，见图2、3。子宫内膜癌组织中TILs上的PD1、PD-L1阳性率分别为 34.38%(33/96)、36.46%(35/96)，高于正常子宫内膜组织中TILs上的PD1、PD-L1阳性率[14.71%(10/68)、20.59%(14/68)]，差异有统计学意义(P<0.05)。子宫内膜癌T淋巴细胞上的PD1、PD-L1阳性率分别为16.67%(16/96)、19.79%(19/96)，与正常子宫内膜组织T淋巴细胞上的PD1、PD-L1阳性率[17.65%(12/68)、16.18%(11/68)]比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A1为正常子宫内膜CD8表达;A2为子宫内膜癌CD8表达;B1为正常子宫内膜 CD68表达；B2为子宫内膜癌CD68表达；C1为正常子宫内膜FoxP3表达;C2为子宫内膜癌FoxP3表达。

注：A1为正常子宫内膜PD1表达；A2为子宫内膜癌PD1表达；B1为正常子宫内膜PD-L1表达；B2为子宫内膜癌PD-L1表达。

注：A1为正常子宫内膜PD1表达；A2为子宫内膜癌PD1表达；B1为正常子宫内膜PD-L1表达；B2为子宫内膜癌PD-L1表达。

2.3子宫内膜癌患者PD1、PD-L1在TILs与T淋巴细胞上表达的相关分析 子宫内膜癌患者PD1、PD-L1在TILs与T淋巴细胞上的阳性率无关(P>0.05)。见表1。

2.4CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1与子宫内膜癌患者年龄及临床病理特征的关系 CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1在病理学分级G3、有淋巴结转移子宫内膜癌组织中的阳性率高于在病理学分级G1～G2、无淋巴结转移子宫内膜癌组织中的阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 PD1、PD-L1在TILs与T淋巴细胞上表达的相关分析(n)

表2 CD8、CD68、FoxP3、PD1、PD-L1与子宫内膜癌患者年龄及临床病理特征的关系(n)

项目nPD1(+)χ2PPD-L1(+)χ2P年龄(岁)1.241<0.050.658<0.05 <49381513 ≥49581822病理学分级6.520<0.056.021<0.05 G1～G24556 G3512829肿瘤分期3.025<0.050.424<0.05 Ⅰ421316 Ⅱ～Ⅲ542019淋巴结转移4.025<0.055.201<0.05 有221819 无74516

3 讨 论

PD1、PD-L1可相互作用，共同对T淋巴细胞活性产生抑制，T淋巴细胞正常传递和激活功能下降后，可抑制肿瘤免疫机制进而形成肿瘤微环境。二者在细胞组织中表达，具有影响细胞黏附、生长、凋亡、增殖、炎性反应、免疫调节等多种生物学功能。王钰聪等[8]发现，PD1、PD-L1在非小细胞肺癌细胞质或细胞质基质中表达上调时，患者5年生存率更低。DURUISSEAUX等[9]采用抗PD1、PD-L1的人源化单克隆抗体治疗肺癌后发现，T淋巴细胞功能和肺癌耐药性均明显升高，提示PD1、PD-L1可诱导癌细胞耐药。以上研究表明，PD1、PD-L1可促进肿瘤细胞发展。目前，抗PD1、PD-L1的人源化单克隆抗体已获得批准用于治疗转移性尿路上皮癌及三阴性乳腺癌等，药物安全性试验结果表明，当PD1、PD-L1阳性表达时治疗客观缓解率更高[10]。因此，推测进行PD1、PD-L1表达的监测对于疾病发展的预测有重要价值。本研究结果显示，PD1、PD-L1在子宫内膜癌组织中TILs及T淋巴细胞上均呈阳性表达，且子宫内膜癌组织中TILs上的PD1、PD-L1阳性率明显高于正常子宫内膜组织中TILs上的PD1、PD-L1阳性率。进一步分析二者与子宫内膜癌病理特征的关系，发现当PD1、PD-L1阳性率升高时，病理分级越高，更易发生淋巴结转移。这与国内学者田大伟等[11]的研究结果基本一致，PD1、PD-L1可促进肿瘤细胞生长和增殖。另外，本研究中PD1、PD-L1阳性率低于PRAT等[12]的报道，考虑与本研究样本量较少有关。

TILs包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK 细胞，当T淋巴细胞通过激活而聚集后可刺激PD1/PD-L1途径逃脱免疫系统清除肿瘤细胞。本研究中CD8、CD68、FoxP3和PD1、PD-L1在子宫内膜癌中均呈阳性表达。另外，T淋巴细胞中PD1、PD-L1阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明T淋巴细胞中的PD1、PD-L1表达数量并不能决定癌症的发生和发展。沈辉等[13]的研究结果显示，TILs比例较高的乳腺癌患者经化疗或分子靶向治疗后，高TILs表达患者无病生存期高于低TILs表达患者。ZHU等[14]的研究指出，CD8、CD68、FoxP3在膀胱癌组织切片中阳性率低于正常膀胱组织。本研究结果显示，CD8、CD68、FoxP3阳性率越高，病理分级越高，且存在淋巴结转移，与上述研究结果一致。分析其作用机制可得，肿瘤患者在接受化疗药物治疗后，肿瘤细胞会释放出肿瘤相关抗原，从而触发对肿瘤细胞免疫应答反应。CD68为一类可检测人体组织中巨噬细胞的分子标记物，可调节巨噬细胞浸润导致的血管新生、癌浸润深度、病理分期等的发展。CD8、CD68、FoxP3高表达与肿瘤细胞的免疫应答反应相关，可促进肿瘤细胞坏死，进而提高治疗客观缓解率。李国等[15]的研究结果显示，向机体回输CD8+T淋巴细胞型细胞因子后，肿瘤微环境中CD4+TILs抗肿瘤作用增强。

综上所述，PD1、PD-L1在子宫内膜癌组织中呈高表达，而CD8、CD68、FoxP3呈低表达，且与子宫内膜癌临床病理特征关系密切，考虑可通过人为干预治疗改变PD1、PD-L1比例，增强患者免疫调节能力，为治疗子宫内膜癌提供新的策略依据。但由于研究时间短，本研究未对患者的长期生存率进行分析，暂不能明确PD1、PD-L1靶向治疗药物的有效性，关于PD1、PD-L1靶向治疗药物的应用和开展仍需在临床中进一步探讨。