热带盐场域近海及潮间带沉积物可培养细菌遗传多样性

陈永敢，王小琴，谢小玲，李 珍

(1.海南热带海洋学院热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室，三亚 572022；2.海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室，三亚 572022；3.海南热带海洋学院水产与生命学院，三亚 572022)

盐场周边环境长期处于高盐状态，对微生物有着强烈的选择性，通常情况下，具备耐盐能力的菌株才能生长。由于盐场土可溶性盐离子浓度高、水热条件差、可供微生物利用的营养含量低，土壤微生物总量较同生态区土壤低。特别是在微生物结构方面，滩涂盐碱土壤中细菌占绝对优势，丰度显著高于真菌和放线菌，细菌总量与农田土壤无差异外，真菌、放线菌均降低。对松嫩平原盐碱地及新疆阿克苏盐碱地土壤样品研究表明，这些地区土壤中微生物多样性丰富，且存在许多未被认识的新物种和生物活性菌株[1]。

在保加利亚沿海盐田异养嗜盐细菌的多样性的研究表明，获得的革兰阴性细菌属于Halomonas、Chromohalobacter、Salinivibrio、Cobetia及Nesiotobacter，而Virgibacillus、Salinicoccus及Brevibacterium为阳性菌的主要类群[2]。另一项关于法国地中海沿岸附近盐土沉积物中细菌生物多样性变化的研究显示，沉积物样品中主要存在Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi及Firmicutes门，而土壤样品中存在Proteobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Actinobacteria、Firmicutes及Acidobacteria门[3]。这些研究关注的焦点集中在盐场土壤，然而盐场域近海及潮间带同样处于一个特殊的生境状态，是高盐环境向海洋过渡的场所，特别是其近海及潮间带沉积物中可培养细菌资源迄今鲜见报道。

莺歌海位于海南省西南部乐东县境内，背靠尖峰岭，全年少雨，且集中在7月、8月、9月3个月份。由于地处热带，光照充足，长年盛行东南风，莺歌海年蒸发量远高于年降雨量，因此诞生了海南最大的海盐生产基地——莺歌海盐场。莺歌海海岸带区域生态环境保存良好，而临近的高盐环境对细菌生长有着强烈的选择作用，是开展热带盐场域近海及潮间带沉积物细菌资源研究的良好场所。近海及潮间带处于海陆交汇带，是营养盐再生与转化发生的重要场所，其中多种细菌类群在碳氮循环中扮演重要角色，与全球面临若干重大生态问题都有一定关系[4]。迄今关于中国近海及潮间带细菌资源研究主要集中在华北地区和江浙沿海一带[5-6]。现从莺歌海盐场域近海及潮间带收集沉积物样品，分离可培养细菌，掌握菌株分类学地位，为了解热带盐场域近海及潮间带沉积物可培养细菌资源组成，同时也为进一步探讨其生态作用提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 沉积物样品采集

于2018年7月收集样品，选定热带盐场域莺歌海近海及潮间带沉积物采样区域，以“五点采样法”采集近海沉积物和距离表层10 cm深度潮间带沉积物作为样品，4 ℃保存备分菌。

1.2 菌株分离、纯化及形态观察

将1 g样品加入无菌水进行系列梯度稀释，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基，28 ℃培养，每个样品设3个平行。

1.3 基因组DNA提取、PCR扩增及测序

基因组DNA提取及目的片段扩增参照Chen等方法[7]。采用细菌特异引物A(8-27f)和B(1523-1504 r)扩增16S rDNA片段，PCR产物委托华大基因测序。

1.4 系统发育学分析

在NCBI和RDP数据库搜索菌株16S rDNA同源序列，根据比对结果选取不种代表性菌株分析。采用ClustalX 1.83[8]比对序列，系统发育分析采用MEGA 5.05[9]软件，以自展法检测，循环1 000次，采用邻接法、最大简约法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态

莺歌海沉积物呈颗粒砂砾状、浅棕色、质地细、杂质少[图1(a)]。近海沉积物样品含菌量为(42 667±577) CFU/g，经纯化后获得9株细菌，潮间带沉积物样品含菌量为(2 500±20) CFU/g，纯化后获得8株细菌。细菌菌落形态简单，呈乳白色或淡黄色，显微观察均为杆状、棒状、圆形[图1(b)、图1(c)]。

图1 莺歌海海岸带环境及可培养细菌分离Fig.1 Coastal environment of Yinggehai and culturable bacteria isolation

2.2 菌株的相似性比对

分离自近海沉积物的菌株(YGHWSB)16S rDNA序列在NCBI、RDP数据库中比对，均与Bacillus属菌株相似性最高(表1)。菌株YGHWSB2、YGHWSB3、YGHWSB4、YGHWSB5、YGHWSB6、YGHWSB10、YGHWSB21与Bacillusamyloliquefaciens相似性最高；菌株YGHWSB13与B.altitudinis相似性最高；菌株YGHWSB30与B.aerophilus相似性最高。分离自潮间带沉积物的8株细菌菌株(YGHISB)分类学地位较复杂，与5个属的菌株相似。菌株YGHISB1、YGHISB2、YGHISB3、YGHISB4与Acinetobacterjohnsonii相似性最高；YGHISB5、YGHISB6、YGHISB7、YGHISB8分别与Massiliahaematophila、Pseudomonaspsychrotolerans、Pantoeaeucrina、Paenibacilluspeoriae相似性最高。这些结果说明莺歌海近海沉积物中可培养细菌资源在分类学地位上的单一性，而潮间带沉积物细菌资源则存在丰富的多样性。

2.3 菌株的多样性分析

将17株菌株在NCBI及RDP数据库比对，挑取相似性高的代表性菌株构建系统发育树(图2)。基于16S rDNA序列构建的最大简约树和邻接树结构相似，结果显示分离自近海沉积物的9株菌株均与Bacillus属聚类，其中7株菌株YGHWSB2、YGHWSB3、YGHWSB4、YGHWSB5、YGHWSB6、YGHWSB10、YGHWSB21与B.amyloliquefaciens聚为一支；菌株YGHWSB13、YGHWSB30则与B.altitudinis、B.aerophilus、B.stratosphericus、B.xiamenensis聚为一支。分离自潮间带沉积物的8株菌株在聚类上较分散，YGHISB1、YGHISB2、YGHISB3、YGHISB4与A.johnsonii聚类；而其他4株菌株YGHISB5、YGHISB6、YGHISB7、YGHISB8分别与4个属的菌株M.haematophila、P.psychrotolerans、P.eucrina、P.peoriae亲缘关系较近。这些结果展现了分离自潮间带沉积物的可培养细菌存在丰富的遗传多样性。

3 讨论

近海沉积物中存在丰富的细菌资源，采用多相分类法，从中国黄海分离鉴定了Motiliproteussediminis[10]；从威海近海沉积物中分离鉴定了Aquimarinasediminis、Thalassotaleasediminis、Mangrovibacteriummarinum、Algoriphagusformosus[11-14]；从青岛近海沉积物中分离鉴定了Litoribacillusperitrichatus、Litorilituussediminis[15-16]。然而研究中分离到的可培养菌株经NCBI、RDP数据库比对及系统发育学分析属于Bacillus，这反映莺歌海近海沉积物可培养细菌资源分类地位单一，可能与莺歌海采样点附近海岸带尚未开发，自然环境受污染较小有关，近海沉积物中可培养细菌主要为土著菌群Bacillus。

相对于近海沉积物中微生物受到广泛关注，潮间带沉积物微生物研究明显少很多。从天津临港工业区潮间带筛选出17株石油烃降解菌，其中柴油降解率较高的2株细菌Y4和Y7均为革兰阴性短杆菌，根据理化性质初步确定为Pseudomonas[17]；浙江镇海潮间带沉积物中可培养微生物初步研究表明，存在Erythrobacter、Jannaschia、Rhodobacter、Roseicyclus、Ruegeria、Acinetobacter、Pseudomonas、Bacillus、Ornithinibacillus、Thalassobacillus、Algoriphagus、Robiginitalea、Gordonia菌株资源[5]。与这些研究相似，常见的海洋细菌Acinetobacter、Pseudomonas也在研究中被分离到，不同的是，另外3个属Massilia、Pantoea、Paenibacillus的菌株则是第一次报道，反映了莺歌海地处中国热带，潮间带沉积物可培养细菌资源与中国华北及浙江等地有着显著的差异。

表1 菌株序列比对Table 1 Sequence blast of culturable microorganisms

图2 根据分离菌株16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees based on 16S rDNA sequence of strains

从潮间带沉积物中分离到8株菌株经鉴定为5个属，而从近海沉积物中分离到的9株菌株仅为1个属，体现了潮间带沉积物中可培养细菌存在丰富的多样性，可能原因在于潮间带环境与生态系统受到陆地和海洋双重作用，多样的环境为多种不同细菌的生长提供了适宜环境，造成其存在着丰富的细菌资源多样性。

4 结论

莺歌海近海沉积物中分离到9株细菌菌株均属于Bacillus，潮间带沉积物中分离到8株细菌菌株分别属于Acinetobacter、Massilia、Pseudomonas、Pantoea、Paenibacillus，反映了莺歌海近海沉积物中可培养细菌资源分类地位单一，而潮间带沉积物由于所处环境变化多样，可培养细菌资源多样性丰富。