畲药十二时辰及其混淆品基原植物基因组DNA提取及鉴别

何舒澜，李泳宁，朱扶蓉

（福建卫生职业技术学院，福建 福州 350101）

0 引言

【研究意义】畲药十二时辰是福建地区民间常用中草药之一，在福安等地多见，其药性辛温，辛可活血通络，温可散寒除湿，亦可利水，常用于治疗二便不通、妇女闭经、风湿痹痛等疾病[1]。畲药十二时辰的基原植物来源于毛茛科重瓣绿花铁线莲（Clematis florida Thunb.Var.plena D.Don），也称为闽产重瓣铁线莲[2]。畲药十二时辰以基原植物的根入药，但多种植物的地下部分在外观与色泽方面与其十分相似，给准确鉴别畲药十二时辰带来困难。传统中草药的真伪鉴别常采用性状、显微等方法进行，对混淆品鉴别的精度有限，常无法准确地判断混淆品的基原，因此探索一种快速、准确鉴别畲药十二时辰基原的方法迫在眉睫。【前人研究进展】目前对畲药十二时辰的研究主要集中在对其成分的提取方法优化、化学成分分析、毒性研究、药效机制研究等方面[3−6]，对其真伪鉴别的研究依然停留在性状鉴别与显微鉴别层面[7]。近年来随着分子生物学的快速发展，中草药的鉴定开始走向分子水平[8−13]，为畲药十二时辰开展分子生药学研究提供了可能。【本研究切入点】要开展畲药十二时辰的分子鉴定首先需要对其基因组DNA进行提取，目前通过分子生药学方法鉴别畲药十二时辰的真伪鲜有报道。【拟解决的关键问题】本试验拟优选提取畲药十二时辰DNA的最佳方法，并通过真伪品DNA的双向测序，实现真品与常见混淆品的准确区分，为进一步开 发应用该福建地区特色中草药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

畲药十二时辰基原植物（闽产重瓣铁线莲）种植于福建卫生职业技术学院药用植物园，经中药教研室鉴定为毛茛科重瓣绿花铁线莲。剪取该植物新长出的幼嫩叶片，作为基因组DNA提取的材料。十二时辰混淆品基原植物购自福建某农产品市场，取残留的叶片作为混淆品基原植物DNA提取的材料。

主要仪器：台式冷冻离心机（湘仪）、电泳仪（北京六一）、精密pH计（雷磁）、PCR仪（珠海黑马）、凝胶成像系统（珠海黑马）、恒温水浴箱（J-MAX）、恒温箱（北京六一）、酶标仪EPOCH2（美国伯腾仪器有限公司）、高速离心机HC-2062（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。主要试剂：琼脂糖（西班牙Biowest）、EDTA（美国Sigma）、Tris（美国Sigma）。引物由北京擎科生物提供。植物基因组DNA提取试剂盒CW0553（ 北京康为世纪）。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

（1）CTAB法 取新鲜叶200 mg，液氮粉碎，加入CTAB缓冲液，水浴60 min后加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1），4 ℃离心后取上清液加入异丙醇继续离心，沉淀加入75%乙醇后再次离心，沉淀物晾干后加入200 μL TE缓冲液，−20 ℃下保存，编号样品1。

（2）改良CTAB法 取新鲜叶200 mg，液氮粉碎，加2%CTAB裂解液震荡后，加入β-巯基乙醇和2%pvp各20 μL后震荡，65 ℃水浴60 min，加入酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），4 ℃离心后取上清液加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1），4 ℃再次离心后取上清液，加入预冷的醋酸钠和异丙醇，−20 ℃放置60 min后4 ℃离心，沉淀75%乙醇洗涤后晾干，加入200 μL TE缓冲液颠倒混匀，−20 ℃下保存，编号样品2。

（3）试剂盒法 取新鲜叶200 mg，液氮粉碎，按照说明书进行提取，提取物编号样品3。

（4）SDS法 取新鲜叶200 mg，液氮粉碎，加入800 μL 10%SDS裂解液，18 μL巯基乙醇，4 mL RnaseA和0.03 g pvp，65 ℃水浴60 min后加入800 μL氯仿-异戊醇（24∶1），4 ℃离心后取上清液加入等体积预冷的异丙醇，−20 ℃放置30 min，4 ℃离心，沉淀75%乙醇洗涤后晾干，加入200 μL TE缓冲液颠倒混匀，−20 ℃下保存，编号样品4。

（5）高盐低pH法 取新鲜叶200 mg，液氮粉碎后迅速加入1 mL65 ℃预热的提取缓冲液，65 ℃水浴120 min后离心，取上清液加入2/3体积KAC（醋酸钾），置冰中30 min后再次离心，上清液加入氯仿-异戊醇后再离心，上清液加入2/3体积预冷异丙醇，离心收集沉淀；加无菌水溶解，离心，用乙醇洗涤后干燥，加200 μL TE缓冲液，−20 ℃下储存 ，编号样品5。

1.2.2 DNA质量检测

（1）琼脂糖凝胶电泳 取5种方法提取的DNA各5 μL，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（120 V、20 min），凝胶成像仪采集照片，考察提取得到的基因组DNA的完整性。

（2）酶标仪测定 通过酶标仪测定样品DNA在260 nm和280 nm处的OD值，根据OD260/280的值判断提取基因组DNA的纯度。

（3）PCR扩增分析 SSR引物的筛选：选取11对引物[14]，具体信息见表1，对样品基因组DNA进行扩增分析。SSR扩展反应体系包含模板DNA 2 μL，引物各1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，总体积为30 μL。扩增条件为94 ℃预变性2 min，后进行40个循环，含94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增结束后72 ℃终延伸5 min。PCR产物电泳选用1×TAE配制2%琼脂糖凝胶，灌胶前加入0.5 μL EB使终浓度为0.5 μg·mL−1；4.5 μL PCR产物中加入0.5 μL 10×loading buffer，上样。150 V恒压电泳。溴酚蓝迁移至电泳胶2/3处停止电泳；凝胶成像系统下观察并记录试验结果，根据扩增效果选择4种引物用于后续试验。

SSR引物扩增分析：不同提取方法提得的基因组DNA用SSR引物筛选得到的4种引物进行扩增分析，SSR扩展反应体系、扩增条件、琼脂糖电泳法与1.2.2中PCR扩增分析项下SSR引物筛选条件相同，观察并记录试验结果。

表 1 引物信息Table 1 Information on primer

ITS2序列扩增分析：以所提取的基因组DNA为模板，利用引物P1：5′－AGAAGTCGTAACAAGGT TTCCGTAGG－3′，P4：5′－TCCTCCGCTTATTGAT ATGC－3′进行扩增鉴定[15]，ITS2引物PCR反应体系包含模板DNA 2 μL，引物各1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，总体积为30 μL。扩增条件为94 ℃预变性5 min，后进行35个循环，含94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，扩增结束后72 ℃终延伸10 min。用1×TAE配制2%琼脂糖凝胶，灌胶前加入0.5 μL EB使终浓度为0.5 μg·mL−1；4.5 μL反应产物中加入0.5 μL 10×loading buffer，上样。150 V恒压电泳。溴酚蓝迁移至电泳胶2/3处停止 电泳；凝胶成像系统下观察并记录试验结果。

1.2.3 分子生药学鉴别

（1）DNA的提取 综合1.2.1与1.2.2的结果，选取最合适的提取方法提取畲药十二时辰基原植物基因组DNA，编号样品6。同法提取常见混淆品叶片的DNA，编号样品7。

（2）PCR扩增 对样品6与样品7进行PCR扩增，选用引物及条件同1.2.2中PCR扩增分析项下ITS2序列扩增分析，产物进行双向测序。

（3）序列拼接与分析 测序得到的序列进行拼接及人工校对，根据GenBank中相似度最高物种的ITS序列边界，截取待鉴定样本的ITS序列。根据文献[16]，被子植物大多数科属其ITS序列的种间差异值为1.2%～10.2%，属间差异值为9.6%～28.8%，相似度＞98%可作为种的溯源依据，通过相似度分析和DNA条形码溯源鉴定畲药十二时辰药材及混淆品的 基原植物来源。

2 结果与分析

2.1 凝胶电泳检测

如图1显示，试剂盒法提取的DNA电泳完整，亮度较高；改良CTAB法提取的DNA电泳也较完整，亮度也高，与试剂盒法效果相近，CTAB法提取的DNA虽有一定拖尾，但带型尚可，亮度也较高；高盐低pH法提取的DNA虽然带型单一，但亮度较暗；SDS法提取的DNA存在拖尾，且亮度较暗。可见SDS法提得的DNA最不理想，因此选择CTAB法、改良CTAB法、高盐低pH法、试剂盒法4种方法 进行后续试验。

2.2 酶标仪检测DNA的纯度

当OD260/280介于1.70～1.90时，表示提取DNA的纯度较高，质量较好，若低于1.70或高于1.90则表示DNA降解或受到糖类、蛋白质、RNA的污染[17]。由表2可见，试剂盒法与改良CTAB法提得的DNA纯度较高，质量较好；高盐低pH法提得的DNA纯度 稍差，SDS法提得的DNA纯度最差。

图 1 DNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA

表 2 DNA的OD260/280与模板浓度Table 2 OD260/280 and template concentration of DNA

2.3 11种引物的SSR扩增产物电泳

图2显示，11种引物A～K均能在基因组DNA中得到扩增，根据条带的明亮清晰及位置，选择A、E、F、J四种引物进行后续试验。

图 2 11种引物扩增后琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 11 primers after amplification

2.4 不同DNA提取方法的SSR扩增产物电泳

图3显示，CTAB法、改良CTAB法、试剂盒法提取得到的基因组DNA使用引物A、E、F、J进行扩增，均能得到清晰的片段，但用高盐低pH法提取得到的基因组DNA使用引物A、E、F、J进行扩增 ，均未出现条带。

2.5 ITS2序列扩增产物电泳

图4显示，用试剂盒法、改良CTAB法、CTAB法提得的基因组DNA均能完全扩增，条带清晰明亮。但高 盐低pH法提得的DNA无法扩增，未显示出条带。

2.6 生药学鉴别结果

如图5显示，样品6与样品7进行PCR扩增后条带清晰。样品6扩增测序后将拼接后截取好的十二时辰序列输入GenBank 中进行BLAST比对，相似度超过99.5%有3个，分别为Clematis florida（AB 120186.1）、Clematis florida（KC004031.1）、Clematis florida（AB775160.1），验证结果可靠，表明使用筛选方法所提取的十二时辰原植物基因组DNA能用于该品种的分子生药学实验并准确鉴别十二时辰（重瓣铁线莲）真品。样品7扩增测序、拼接后截取的ITS 序列相同，输入GenBank 中进行BLAST比对，相似度大于98.5%的有Ardisia pusilla（MF682166.1）与Ardisia pusilla（FJ482140.1）。混淆品为紫金牛科的九节龙。如图6显示，通过分子生药学鉴别，能准确鉴别畲药十二时辰真品与混淆品。

图 3 SSR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of SSR amplification products

图 4 ITS2扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of ITS2 amplification products

图 5 样品6与样品7的ITS2扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 5 Agarose gel electrophoresis on ITS2 products of Sample 6 and 7

畲药十二时辰可通经络，在福建福安等地常用于治疗跌打损伤，而混淆品九节龙的根也被用于治疗跌打损伤[18]，且两者的根比较相似，容易造成混淆。传统的生药学鉴定除性状鉴定外，一般需要制作粉末临时标本片及组织切片进行显微鉴定，操作步骤繁琐且显微鉴定依然无法解决真伪品的基原问题，基原鉴定传统上依然需要经过实地走访调研、采集植物标本、观察植物器官，比对数据库文献及实物标本等步骤。随着分子生药学的发展，通过DNA鉴定来准确便捷地鉴别真伪品的基原，无疑对中草药的真伪鉴别更有价值。

图 6 16Sr DNA基因序列系统发育进化树Fig. 6 Phylogenetic tree of 16Sr DNA gene sequence

近年来，对植物DNA提取的报道很多[19−23]，均能有效地提取到植物的基因组DNA，但由于畲药十二时辰中含有大量的蛋白质，多酚，多糖等成分，给高质量基因组DNA的提取增加了困难。在本试验中，畲药十二时辰新鲜叶片采用CTAB法、改良CTAB法、CW0553试剂盒法均可提得满足后续分子生物学试验需要的基因组，但高盐低pH法与SDS法并不适用。SDS法提得的基因组DNA的纯度和浓度都很低，可能与提取过程中DNA出现降解有关。而高盐低pH法在使用文中不同引物时都无法实现扩增，而其他方法提得DNA使用相同引物均可实现扩增，说明高盐低pH法提取的基因组DNA质量不高。CTAB法作为提取植物DNA的常用方法对除去其中所含的多糖类杂质效果较好，但常规CTAB法不太适用于含有较多酚类等次生代谢产物的植物组织，因为这类代谢产物用该法不易去除。改良CTAB法，加入的PVP可减少DNA中酚的污染，β-巯基乙醇的使用也阻止酚氧化成醌，使酚的去除更加容易，提升了所提取基因组DNA的质量。结果表明，改良CTAB法的提取效果优于常规CTAB法，后续还可以通过方法学进一步优化改良CTAB的提取效果。从提得样品基因组DNA的纯度来看，改良CTAB法与试剂盒法提取效果相当，但操作简单，节省了试验时间。改良CTAB法提取得到的基因组DNA经PCR扩增后的产物可用于双向测序，进而鉴别其基源，可与常见混淆品准确区分，说明通过分子生药学方法鉴别畲药十二时辰的真伪准确可行。

可见，本研究建立的改良CTAB法能有效地提取畲药十二时辰的基因组DNA，方法操作简单、DNA质量较好，并可用于畲药十二时辰与混淆品的分子生药学鉴别。