体外诊断试剂阳性判断值或参考区间研究解析

【作 者】徐超，刘容枝

国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心，北京市，100081

0 引言

体外诊断试剂的临床应用在于通过对患者样本的检测实现对疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察（判断）和健康状态评价。产品检测结果的正常与否需通过其阳性判断值或参考区间进行判定，因此，阳性判断值或参考区间是产品不可或缺的属性。阳性判断值或参考区间在临床检验活动中的作用相似，但又存在差异，阳性判断值侧重于对检查对象的某种疾病状态的判定，而参考区间在我国又被称为“参考范围”“正常范围”“正常值”等，其侧重于提示检查对象是否“正常”。

1 概述

阳性判断值为临床上认识疾病程度及决定处理措施时的某一检验项目的分界值。它是临床医生处理患者的“阈值”，当检测结果高于或低于某个阳性判断值时，医生应结合患者临床症状做出相应的临床决策，可对疾病排除或确认，或对疾病分级，或评估预后，或提示应采取措施处理[1]。例如：风疹病毒IgM抗体检测试剂盒，检测结果大于该产品阳性判断值，可对患者进行风疹病毒感染的辅助诊断；过敏原特异性IgE检测试剂，检测结果大于该产品的阳性判断值，可对患者过敏性疾病进行辅助诊断。因检测结果可能受多种因素的干扰，且每一个阳性判断值的设定，均导致产品具有特定临床灵敏度与临床特异性，所以检测结果显示阳性，并不一定代表检测对象患病或处于某种疾病状态，应结合患者具体信息进行分析。

参考区间为某一标志物在正常（健康）人群中的测量值范围，是临床医生区别患者“正常”与“非正常”的标准，参考区间一般不同于疾病的辅助诊断[2]。例如铁蛋白检测试剂盒，检测结果低于参考区间，可提示检测对象可能存在缺铁性贫血、妊娠等；检测结果高于参考区间，可提示检测对象可能存在原发性血色病、炎症或感染、慢性肝病等。参考区间不同于阳性判断值，其建立过程依赖于参考人群，并未纳入某种特定疾病的患病人群，因此参考区间往往不针对某一种疾病。

基于阳性判断值与参考区间的差异，生产企业在进行相关研究时，应充分考虑产品的预期用途、方法学及检测标志物在人体正常与疾病状态下的存在情况等因素选择研究方法。同时已上市的同类产品选择的是阳性判断值还是参考区间对于生产企业确定此项研究也可提供重要参考。

2 国内外现状

国际上医疗器械监管机构在体外诊断试剂上市前审评过程中对产品的阳性判断值及参考区间的研究资料均有要求，国际医疗器械监管者论坛（IMDRF）发布的《医疗器械和体外诊断试剂安全和性能的基本原则》[3]，针对体外诊断试剂明确提出了有关阳性判断值及参考区间的要求。

在我国体外诊断试剂注册过程中，生产企业应提交其产品的阳性判断值或参考区间的研究资料。根据《体外诊断试剂说明书编写指导原则》要求，将产品阳性判断值或参考区间载明于产品说明书中，并简要说明阳性判断值或参考区间的确定方法。在产品注册证有效期内，产品阳性判断值或参考区间可随着后续研究或参考文献的更新而发生相应变化。如产品阳性判断值或参考区间变化，同时产品具有新的临床诊断意义，则此类变化不在体外诊断试剂变更注册范畴之内。

3 阳性判断值及参考区间的建立

3.1 阳性判断值的建立

阳性判断值作为体外诊断试剂的一个重要属性，其建立过程应在完成产品前期研发且产品定型以后。任何体外诊断试剂在临床应用过程中均存在一定临床灵敏度与临床特异性，理论上不存在灵敏度与特异性均为100%的产品，因此生产企业应综合产品预期用途，在充分考虑产品临床灵敏度与临床特异性的基础上，采用合理的方法建立阳性判断值。受试者工作曲线（ROC曲线）是建立产品阳性判断值的常用方法之一[4]。ROC曲线即以灵敏度为Y坐标，1-特异性即假阳性率为X坐标作图得到的曲线，通过ROC曲线，可观察灵敏度与特异性之间的关系。一般来说，灵敏度增高，则特异性降低，反之亦然。如研究者预期获得综合灵敏度与特异性最优的结果，则将ROC曲线上最靠近左上的一点作为产品阳性判断值，这一点对应的灵敏度与特异性即为产品的性能。

研究者通过ROC曲线进行阳性判断值的研究过程中，应重点考虑产品阳性判断值与产品预期用途的适应性，如某些筛查用产品，其临床应用过程中不期望有过多的检测对象被漏诊，此类产品阳性判断值设定过程中应适当考虑在其特异性满足要求的前提下，尽量提高其灵敏度，如某些临床用于确认的产品，其临床应用过程中不期望有过多的检测对象被错误的报告为阳性，此类产品阳性判断值设定过程中应考虑其灵敏度满足要求的前提下，尽量提高其特异性。

研究者通过ROC曲线进行阳性判断值研究过程中，应注意研究过程的科学严谨。第一，研究过程中，应同时入组患病人群（疾病组）与正常人群（正常组），两组人群的病例数应满足统计学要求[5]；第二，在疾病组入组过程中，相应入组人群及样本类型应与产品预期用途一致，同时入组人群应考虑性别、年龄等因素；第三，患病人群的纳入应连续，连续纳入应考虑疾病不同的进程，如：极早期、早期、中期、晚期等，保证每阶段均有一定的病例数量；第四，研究过程中应采用疾病诊断金标准或其他公认的诊断标准对入组的病例是否患病进行确认，必要时应对入组患者进行跟踪随访，当有些诊断标准是有创性的，如穿刺活检等，此类标准从伦理上讲不能用于正常人群未患病的确认，那么针对正常人群需进行跟踪随访以确认是否患病；第五，某一标志物可能对应多个临床适应症，针对不同临床适应症应分别进行阳性判断值的研究；第六，研究过程中应有相应质量控制，以保证研究结果的准确可靠[6]。以上仅是对ROC曲线研究过程中应重点关注的内容进行概述，因为此项研究影响因素较多，研究者应从产品自身实际出发，设计合理的研究方案。

案例分析：miR-92a检测试剂盒（荧光 RTPCR 法）阳性判断值的建立。产品预期用途为体外定性检测人粪便样本中的 miR-92a核酸，临床上用于对大肠癌的辅助诊断。该产品采用受试者工作曲线（ROC曲线）进行阳性判断值的建立。基于该产品预期用途，阳性判断值建立过程需同时纳入经临床诊断确诊为大肠癌的病例及经临床诊断明确为非大肠癌的病例。研究过程共纳入大肠癌病例226例，病例涵盖了大肠癌不同的分型、分期；同时，为了更充分研究产品的阳性判断值，纳入了健康人及其他非大肠癌病例，其中健康人199例、息肉患者36例、肝癌患者30例、肠炎患者30例、食道癌患者30例、胃癌患者30例、腺瘤患者30例、胃炎患者30例、阑尾炎患者30例、结肠炎患者30例、消化性溃疡患者30例、胰腺癌患者30例、胆管癌患者30例、口腔癌患者30例，非大肠癌病例总计595例。采用 miR-92a检测试剂盒（荧光 RT-PCR 法）对其进行检测，检测结果采用SPSS 15.0统计分析软件进行 ROC 曲线分析，根据约登指数的分析结果，取约登指数最大所对应的CT值30.75为阳性判断值（cut off value）。本研究从病例的确认方法、病例数量、病例的多样化等方面均满足产品阳性判断值的建立过程。

3.2 参考区间的建立

参考区间的建立同样应在产品完成前期研发且产品定型以后。参考区间与阳性判断值不同，其为某一标志物在正常（健康）人群中的测量值范围。参考区间的建立一般需经过如下过程[7]：参考个体的选择、参考人群的确定、参考样本组的确定、检测样本量值、统计量值分布、计算参考限值、得出参考区间。参考区间建立过程中，每一步骤的研究质量均会影响参考区间的科学性。

参考区间可能与健康或与其他生理或病理状况有关，因此，确认参考个体的健康状态非常关键。健康状态的确认可采取排除法，每一项研究均有不同的健康排除标准，如：饮酒、疾病（最近）、献血、哺乳期、血压（异常）、肥胖、药物滥用、职业、处方药、口服避孕药、自服药、怀孕、环境因素、手术（最近）、空腹或不空腹、吸烟、遗传因素、输血（最近）、住院（最近或正在）、维生素滥用等。一个准参考个体的健康状态需经过一系列检查才能确定，这些检查包括病历检查或现状态生理指标的临床实验检查。用于参考值研究的标准应具有详细的描述和证明，实验操作者根据此标准来判定参考样品组的健康状态。

参考群体在选择的过程中还应关注年龄、性别、种族、生理病理状态等因素，参考群体的这些特征应与产品预期使用人群的特征类似。许多情况下，与年龄相关的实验室指标改变可能不代表健康状况的变化，如老年人的总胆固醇或生长激素水平改变，因此年龄相关的参考区间更适用于临床诊断，针对不同年龄段参考区间存在差异的产品，应根据产品临床用途对不同年龄段的参考区间进行建立；对于某些标志物来说，男性与女性存在差异，如促卵泡生成素，男性与女性在参考区间上存在明显差异，此类产品参考区间应针对男性和女性分别研究；针对某些检测项目，参考区间容易受到种族等因素的影响，针对此类检测项目，在参考区间的建立过程中应考虑产品适用的人群种族情况，特别是进口产品，如其境外上市的参考区间不适用于我国人群，应针对我国人群重新建立参考区间，而不能简单地沿用境外上市的参考区间；有些参考区间容易受到目标人群生理状态的影响，如抗缪勒管激素，其参考区间在女性绝经前与绝经后存在差异，此类产品其参考区间应针对不同生理状态进行研究[8]。以上仅为几种分类分层统计的举例，研究者应根据产品具体情况设定参考人群。

参考区间研究过程中应充分合理地利用统计学，应采用合理的方法明确研究过程中是否存在异常值，如存在应将异常值剔除，如剔除异常值后样本量不满足统计学要求，应补充相应样本。在统计分析过程中，研究者可根据检测结果的分布（正态分布或偏态分布）情况，选择合理的统计学方法建立参考区间。

针对临床已经广泛开展的检测项目，其相关产品的参考区间也可引用相关临床诊疗指南、诊疗共识，在参考区间引用过程中生产企业应充分考虑产品预期人群、检测的原理（方法学）、检测样本类型等因素。以此方法建立参考区间的生产企业应对参考区间进行充分的验证。

案例分析：癌胚抗原测定试剂盒参考区间的建立。产品预期用途为体外用定量测定人血清和血浆中癌胚抗原含量。主要用于对恶性肿瘤患者进行动态监测以辅助判断疾病进程或治疗效果，不能作为恶性肿瘤早期诊断或确诊的依据，不用于普通人群的肿瘤筛查。基于产品预期用途采用非参数估计的方法建立产品参考区间。研究过程中入组722例经临床诊断排除肿瘤的正常人。人群年龄范围20～70岁，性别包含男性和女性，生活习惯涵盖吸烟者和不吸烟者。将采集的样本采用癌胚抗原检测试剂进行检测。统计分析根据人群差异分为四个亚组，使用非参数方法对各亚组的百分位数进行统计分析，各亚组的中位值和第95百分位数见表1。根据癌胚抗原生物学特性，各人群在临床检测过程中结果小于95%百分位数为阴性，反之为阳性，不同人群的参考区间建立完成。采用非参数法确定参考区间容易受不同人群的影响，因此，推荐各实验室建立自己的参考区间。

表1 不同亚组人群统计分析结果Tab.1 Statistical analysis results of different subgroups

4 阳性判断值或参考区间的验证

为了保证产品阳性判断值及参考区间建立的科学性，生产企业应在产品临床前研究中对建立的阳性判断值或参考区间进行验证，阳性判断值或参考区间的验证所用人群应与建立过程的人群不同[9]。验证试验应选定合理的样本例数，采用采集自产品预期适用人群的样本进行研究。研究过程中注意判断病例为阳性或阴性的方法应与产品阳性判断值建立过程中所采用的方法一致。

产品临床试验是产品阳性判断值及参考区间确认的重要证据。一般来说，产品的阳性判断值应在临床试验前完成建立和验证工作，在临床试验中应根据已经经过充分验证的阳性判断值进行检测结果的判读。如果临床试验中依据临床参考标准认为阳性判断值的设定存在偏差且需要调整，则调整后应重新入组临床病例进行临床试验。

5 小结

阳性判断值或参考区间在临床检验诊断中具有重要的意义，临床医生必须依据科学合理的参考区间对体外诊断试剂产品的检测结果进行判定和解读，从而辅助针对患者的医疗决策，因此阳性判断值或参考区间是产品不可或缺的属性。

阳性判断值和参考区间各有侧重，医疗器械生产企业应根据产品预期用途，提供产品可靠的阳性判断值或参考区间。阳性判断值或参考区间的建立可通过参阅文献或是企业自行制定。阳性判断值的建立：生产企业应充分考虑产品临床灵敏度与临床特异性、阳性判断值与预期用途的适应性，采用合理的方法（例如受试者工作曲线）建立阳性判断值[10]。参考区间的建立：生产企业应谨慎进行参考个体的选择、参考值测量的分析过程。参考群体的特征应与产品预期使用人群的特征类似。如有必要，生产企业应对制定的阳性判断值或参考区间进行验证。

综上所述，生产企业应设定合理的研究方案，以期能够采用科学合理的方式确定阳性判断值或参考区间。