速溶藏茶制备工艺优化、功能性成分及抗氧化性分析

张 恒，郑俏然，何靖柳，韦 婷，刘 翔，章 斌

（1.雅安职业技术学院药学与检验学院，四川雅安 625000；2.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100）

雅安藏茶属于黑茶的一种，是典型的发酵茶，是包括西藏、四川、青海等地域在内的藏区居民的日常必备饮品。雅安藏茶一般选用蒙顶山茶产区产出的1芽5叶以内的新梢作为原料，经过杀青、揉捻、渥堆和干燥等工序制作而成。近年来文献显示其具有抗氧化[1−2]、抗辐射[3]、减肥降脂[4−5]、调理消化系统[6−7]等功效。雅安藏茶主要以泡饮为主，目前对其报道主要还停留在基础研究阶段，对其进行加工应用方面少有报道。

速溶茶粉是一种方便快捷的固体饮料，目前市面上多见速溶绿茶、速溶红茶、速溶乌龙茶等产品，未见速溶藏茶产品，也无文献对此进行过研究与报道。本文以雅安藏茶为原料，以速溶藏茶得率、藏茶多糖提取量和藏茶茶多酚提取量为指标，通过单因素实验和响应面试验优化速溶藏茶提取工艺。考虑到不同干燥方法对速溶茶粉品质影响较多，因此本文进一步分析了冷冻干燥和喷雾干燥两种方式制得速溶藏茶的功能性成分与含量以及体外抗氧化活性，旨在为速溶藏茶产品工业化生产提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藏茶 雅安周公山茶厂，2015年；福林酚、DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐） Sigma公司；没食子酸（GA）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、芦丁（Rutin）、槲皮素（quercetin）、绿原酸（chlorogenic acid） 上海源叶生物技术有限公司；甲醇（色谱纯）德国 Merck 公司;其余试剂 均为国产分析纯。

FW100型万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；HHS-9S恒温水浴锅 上海光地仪器设备有限公司；RE52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；U-1900紫外可见分光光度计 日本日立公司；TDL-5000B冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；TFFD冷冻干燥机 上海拓纷设备有限公司;YC-015喷雾干燥机 上海雅程设备有限公司；超高效液相色谱（Agilent）-三重四极杆质谱仪（6460QqQ-MS/MS）Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 速溶藏茶的制备工艺 藏茶→粉碎→过筛→热水浸提→离心→抽滤→浓缩→干燥→速溶藏茶。将藏茶粉碎后按一定料液比加蒸馏水,水浴加热浸提一定时间，离心（4000 r/min, 10 min），取上层液体抽滤，60 ℃旋转浓缩。冷冻干燥：浓缩茶汁放入−50 ℃中预冻结，再置于真空冷冻干燥机干燥。喷雾干燥：进风温度170 ℃，进料速度12 mL/min。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 料液比对速溶藏茶提取效果的影响 称取藏茶粉按料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）分别加蒸馏水,于70 ℃浸提1 h，浸提1次，浓缩后经过冷冻干燥制得速溶藏茶，测定速溶藏茶得率、藏茶多糖和藏茶茶多酚提取量，考察料液比对速溶藏茶提取效果影响。

1.2.2.2 温度对速溶藏茶提取效果的影响 料液比1:50（g/mL），分别在50、60、70、80、90、100 ℃温度下浸提1 h，浸提1次。浓缩后经过冷冻干燥制得速溶藏茶，测定速溶藏茶得率、藏茶多糖和藏茶茶多酚提取量，考察温度对速溶藏茶提取效果影响。

1.2.2.3 浸提时间对速溶藏茶提取效果的影响 料液比1:50（g/mL），100 ℃下分别浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,浸提1次。浓缩后经过冷冻干燥制得速溶藏茶，测定速溶藏茶得率、藏茶多糖和藏茶茶多酚提取量，考察浸提时间对速溶藏茶提取效果影响。

1.2.2.4 浸提次数对速溶藏茶提取效果的影响 料液比1:50，100 ℃浸提1.5 h,分别浸提1、2、3次。浓缩后经过冷冻干燥制得速溶藏茶，测定速溶藏茶得率、藏茶多糖和藏茶茶多酚提取量，考察浸提次数对速溶藏茶提取效果影响。

1.2.3 响应面分析法对浸提工艺的优化 综合单因素实验的结果，运用Design-Expert 8.0.6软件，设计Box-Behnken试验，以料液比（A）、温度（B）、浸提时间(C)、浸提次数（D）为响应因素，以速溶藏茶得率（Y1）、藏茶多糖提取量（Y2）、藏茶茶多酚提取量（Y3）为响应值，设计四因素三水平响应面分析试验，得出速溶藏茶浸提的最佳工艺参数（表1）。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiments

1.2.4 速溶藏茶得率的计算

1.2.5 藏茶多糖的测定与计算 速溶藏茶中藏茶多糖测定采用苯酚-硫酸法[8]。

1.2.6 藏茶茶多酚的测定与计算 速溶藏茶中藏茶茶多酚测定按照GB/T8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法。

1.2.7 UPLC-QqQ-MS/MS分析条件 样品上机处理：称取0.3 g速溶藏茶加入3 mL 80%甲醇溶液，超声10 min，3000 r/min离心取上清液于4 ℃冰箱静置过夜，再12000 r/min离心，取上清液1 mL过0.22 μm有机相滤膜。

液质联用分析条件：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流动相由水（A）和甲醇（B）组成，各加0.1%甲酸，流速为0.4 mL/min，柱温：30 ℃,进样量：5 μL。梯度洗脱条件如下：6 min内90%～10%B，7 min内10%B，7.5 min内90%B，以及10 min内90%～90%B。

质谱条件：ESI负离子模式，干燥气体流速为10.0 mL/min，雾化气温度350 ℃，毛细管电压为3.5 kV。扫描模式为多反应监测（MRM），目标物监测离子对（m/z）及去簇电压、碰撞能等参数见表2，每个离子对的驻留时间均为0.02 s。

表2 待测物的保留时间和质谱分析条件Table 2 Retention time and MS parameters for the analysis of target compounds

1.2.8 速溶藏茶体外抗氧化活性测定

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力测定 参考文献方法[9−10]，称取速溶藏茶，配制成一定浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的待测样品。取2.0 mL待测样品，加2.0 mL 0.04 g/LDPPH无水乙醇，摇匀，室温下反应25 min，于517 nm处测其吸光值，记为A1。另取2.0 mL待测样品，加入2.0 mL无水乙醇，摇匀，反应25 min，于517 nm处测其吸光值，记为A2，取2.0 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇，加入2 mL无水乙醇，摇匀，做空白对照，于517 nm测其吸光值，记为A0。

式中：A1是样品加DPPH无水乙醇的吸光度，A2是样品加无水乙醇的吸光度，A0是DPPH无水乙醇加无水乙醇的吸光度。

1.2.8.2 ABTS自由基清除能力测定 参考文献方法[11]，称取速溶藏茶，配制成一定浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的待测样品。将7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光室温放置16 h，配制成ABTS+溶液，用无水乙醇将ABTS+溶液稀释至734 nm下吸光值为0.70±0.02。取10 μL样品与200 μL ABTS+溶液混合，30 ℃下避光反应6 min。采用酶标仪测定样品在734 nm处的吸光值A样品，水在734 nm处的吸光值A对照。

1.3 数据处理

所有的实验数据运用Excel和SPSS软件进行基础统计学和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对速溶藏茶提取效果的影响 从图1看出，随着料液比的提高，速溶藏茶的提取效果增强，当料液比在1:20～1:40范围增加，速溶藏茶得率以及藏茶茶多酚和藏茶多糖提取量增加不显著，当料液继续增加到1:50时，速溶藏茶得率以及藏茶茶多酚提取量均较料液比1:20时显著增加（P<0.05），料液比为1:50时产品得率和藏茶多糖提取量达到峰值，因此，选择料液比1:50。

图1 料液比对提取效果的的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on extraction

2.1.2 温度对速溶藏茶提取效果的影响 从图2看出，随着温度的提高，藏茶中的水溶性成分溶出增多，在提取温度50～90 ℃的范围内，随着温度升高，速溶藏茶得率增加显著（P<0.05），藏茶茶多酚提取量和藏茶多糖提取量随着温度升高而提高，温度70～90 ℃范围内增加不显著；90～100 ℃时速溶藏茶得率增加不显著，但藏茶茶多酚提取量和藏茶多糖提取量在此温度范围含量显著增加（P<0.05），所以提取温度应该在90～100 ℃之间。

图2 温度对提取效果的的影响Fig.2 Effects of temperature on extraction

2.1.3 浸提时间对速溶藏茶提取效果的影响 从图3看出，浸提时间为0.5～1.5 h范围内，随着浸提时间延长，速溶藏茶得率和藏茶茶多酚提取量增加，藏茶多糖提取量随着时间延长的变化不显著。浸提时间超过1.5 h，速溶藏茶得率与藏茶茶多酚提取量增加均不显著，说明随着浸提时间的延长，藏茶中浸出成分含量随之增加并达到平稳，因此选择浸提时间为1.5 h。

图3 浸提时间对提取效果的的影响Fig.3 Effects of extraction time on extraction

2.1.4 浸提次数对速溶藏茶提取效果的影响 从图4看出，随着浸提次数的增加，藏茶浸出成分含量增加并达到平稳，浸提次数为2次时，速溶藏茶得率以及藏茶多糖提取量较浸提1次显著增加（P<0.05），浸提次数超过2次，速溶藏茶得率、藏茶茶多酚提取量和藏茶多糖提取量增加均不显著，因此最佳浸提次数为2次。

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 模型建立与显著性分析 根据 Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素实验结果，对速溶藏茶工艺进行响应面分析，以速溶藏茶得率（Y1）、藏茶多糖提取量（Y2）、藏茶茶多酚提取量（Y3）为响应值，以料液比、温度、浸提时间、浸提次数为因素，具体方案和结果见表3。利用Design- Expert 8.0.6软件对表3数据进行多元回归拟合和显著性分析，结果见表4～表6。

图4 浸提次数对提取效果的的影响Fig.4 Effect of number on extraction

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Experimental results of response surface analysis

2.2.1.1 以速溶藏茶得率为响应值 采用Design-Expert 8.0.6软件对表3中数据进行回归拟合，得到自变量与速溶藏茶得率（Y1）的二次多项回归方程为：

表4 响应面模型方差分析Table 4 ANOVA of response surface results

表5 响应面模型方差分析Table 5 ANOVA of response surface results

对模型的方差分析结果见表4，可见对速溶藏茶得率所建立的二次多项式模型具有高度显著性（P<0.01），决定系数R2=0.9672，失拟项不显著，说明建立的模型能够反映响应值的变化，可以用此模型对速溶藏茶得率进行分析和预测。在所选择的试验范围内，影响速溶藏茶得率的因素按主次顺序排列为浸提次数（D）>温度（B）>浸提时间（C）>料液比（A）。在所选各因素水平范围内，B、D、AD、A2、B2、C2、D2对速溶藏茶得率的影响极显著（P<0.01），C、AC、BC、CD对速溶藏茶得率的影响显著（P<0.05），A、AB、BD对速溶藏茶得率的影响不显著。

表6 响应面模型方差分析Table 6 ANOVA of response surface results

2.2.1.2 以藏茶多糖提取量为响应值 采用Design-Expert 8.0.6软件对表3中数据进行回归拟合，得到自变量与藏茶多糖提取量（Y2）的二次多项回归方程为：

对模型的方差分析结果见表5，模型差异极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），说明方程误差小，拟合度较高。一次项B和D对藏茶多糖提取量的影响达到极显著（P<0.01），二次项B2对藏茶多糖提取量的影响达到显著（P<0.05）,其余一次项、交互项和二次项对藏茶多糖提取量的影响不显著。在所选择的试验范围内，影响藏茶多糖提取量的因素按主次顺序排列为温度（B）>浸提次数（D）>料液比（A）>浸提时间（C）。

2.2.1.3 以藏茶茶多酚提取量为响应值 采用Design-Expert 8.0.6软件对表3中数据进行回归拟合，得到自变量与藏茶茶多酚提取量（Y3）的二次多项回归方程为：

对模型的方差分析结果见表6，模型差异极显著（P<0.01），失拟项不显著（P>0.05），说明方程误差小，拟合度较高。A、B、D和A2对藏茶茶多酚提取量的影响达到极显著（P<0.01），CD、B2、C2对藏茶茶多酚提取量的影响显著（P<0.05）。在所选择的试验范围内，影响藏茶茶多酚提取量的因素按主次顺序排列为温度（B）>料液比（A）>浸提次数（D）>浸提时间（C）。

2.2.2 响应面的交互作用分析 将一个因素固定在0水平，其余两因素间交互作用对速溶藏茶提取影响的响应面图见图5。从图5（A）中可以看出料液比与浸提时间的交互作用显著，随着时间的增加，速溶藏茶得率增加显著；从图5（B）中可以看出料液比与浸提次数的交互作用显著，在一定料液比下，随着浸提次数增加，速溶藏茶得率增加极显著;从图5（C）中可以看出温度与浸提时间的交互作用显著，随着提取温度和浸提时间增加，速溶藏茶得率增加显著；从图5（D）、（E）可以看出浸提时间与浸提次数交互作用显著,随着浸提时间和浸提次数增加，速溶藏茶得率和藏茶多酚提取量增加显著。

图5 两因素交互作用对速溶藏茶提取效果的响应面图Fig.5 Response surface of two factors interaction effects on extraction

2.2.3 最佳条件的确定和模型的验证 通过软件分析，速溶藏茶提取的最优工艺条件为料液比1:53.17（g/mL），提取温度98.42 ℃，提取时间1.46 h，浸提次数3次。此时预测速溶藏茶得率为29.85%，藏茶多糖提取量为6.10 g/100 g，藏茶茶多酚提取量为6.36 g/100 g。考虑实际操作性，将参数修正为料液比1:53 （g/mL），提取温度98.5 ℃，浸提时间1.5 h，浸提次数3次。在此提取条件下进行验证试验，三次平行验证实验测得速溶藏茶得率为29.72%±0.13%，藏茶多糖提取量为（6.06±0.03） g/100 g，藏茶茶多酚提取量为（6.27±0.05） g/100 g，与预测值接近，说明回归方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性。

2.3 速溶藏茶中功能性成分分析

按照以上最优条件浸提藏茶，经过离心、抽滤和浓缩以后，用冷冻干燥和喷雾干燥两种干燥方法得到速溶藏茶，测定速溶藏茶中功能性成分的组成和含量，结果见图6、图7。

图6 不同干燥条件下速溶藏茶中功能性成分组成和含量Fig.6 Composition and content of functional components in instant tea under different drying conditions

由图6知，两种干燥方式制得速溶藏茶中均检测到10种功能性成分，包括没食子酸（GA）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）、芦丁（rutin）和槲皮素（quercetin）。对比两种干燥方式，冷冻干燥的速溶藏茶中EGC、EGCG、槲皮素显著高于喷雾干燥的速溶藏茶（P<0.05）；原儿茶酸在喷雾干燥品中显著高于冷冻干燥品（P<0.05），其余功能性成分两种干燥方式差异不显著。

图7 标准品（A）、冷冻干燥（B）和喷雾干燥（C）中10种化合物的色谱图Fig.7 MRM Chromatogram of 10 compounds in Standard sample（A）, freeze-dried（B）and spray-dried（C）

两种干燥方式制得的速溶藏茶中EGCG与GA的含量最高，其次为GCG、ECG，EC含量较少，这与文献报到的藏茶中儿茶素结果一致[12−14]。EGCG、GA、GCG、ECG为黑茶儿茶素的主要成分[15−16]，EGCG作为重要的儿茶素成分，一般占儿茶素的50%左右。对比文献报道的速溶绿茶与速溶铁观音茶等产品[17−18]，本研究制备的速溶藏茶儿茶素含量更低，是因为藏茶属于全发酵茶，随着发酵的进行，黑茶中的氧化和聚合反应会显著降低儿茶素的成分和含量。研究表明原儿茶酸、芦丁、槲皮素等功能性物质在黑茶中广泛存在[19−21]，芦丁、槲皮素和绿原酸具有较强的生物活性[22−24]，由此可见，速溶藏茶具有良好的营养及保健价值。

2.4 速溶藏茶抗氧化活性测定结果

从图8可知，冷冻干燥和喷雾干燥的速溶藏茶在0.2～0.6 mg/mL范围，随着浓度增加，对DPPH自由基清除能力均快速上升，随后趋于稳定，在浓度1.0 mg/mL时，对DPPH自由基清除率为79.7%和75.3%。冷冻干燥速溶藏茶对DPPH自由基清除能力的IC50为0.247 mg/mL，喷雾干燥速溶藏茶对DPPH自由基清除能力的IC50为0.339 mg/mL。

图8 速溶藏茶对DPPH自由基清除效果Fig.8 The scavenging effects of instant tea on DPPH free radical

从图9可知，冷冻干燥和喷雾干燥的速溶藏茶对ABTS自由基清除率在0.2～1.0 mg/mL范围，随着浓度增加呈较陡上升趋势，在浓度1.0 mg/mL时，对ABTS自由基清除率分别为91.8%和83.9%；冷冻干燥速溶藏茶对ABTS自由基清除能力的IC50为0.417 mg/mL，喷雾干燥速溶藏茶对ABTS自由基清除能力的IC50为0.443 mg/mL。

图9 速溶藏茶对ABTS自由基的清除效果Fig.9 The scavenging effects of instant tea on ABTS free radical

速溶藏茶对DPPH自由基和ABTS自由基清除试验结果均显示出，在浓度为0.2～1.0 mg/mL范围内，速溶藏茶对DPPH自由基和ABTS自由基清除率随速溶藏茶浓度增加而增强，呈现出良好的剂量效应关系，速溶藏茶有较强的体外抗氧化活性。干燥工艺对速溶藏茶的体外抗氧化活性有影响，冷冻干燥比喷雾干燥的速溶藏茶抗氧化活性更强。

3 结论

通过单因素实验与Box-Behnken响应面优化试验，确定了雅安藏茶浸提的最佳工艺条件为料液比1:53 （g/mL），温度98.5 ℃，浸提时间1.5 h，浸提次数3次，速溶藏茶得率达到29.72%±0.13%，藏茶多糖提取量为(6.06±0.03) g/100 g，藏茶茶多酚提取量为（6.27±0.05） g/100 g。按照以上条件浸提藏茶，用冷冻干燥和喷雾干燥制备速溶藏茶，利用UHPLCQqQ-MS/MS检测出两种干燥方法制备的速溶藏茶中均含有10种功能性成分，冷冻干燥的速溶藏茶中EGC、EGCG、槲皮素显著高于喷雾干燥的速溶藏茶（P<0.05）；原儿茶酸在喷雾干燥品中显著高于冷冻干燥品（P<0.05），其余功能性成分两种干燥方式差异不显著。速溶藏茶对DPPH自由基和ABTS自由基清除率随速溶藏茶浓度增加而增强，表现出良好的剂量效应关系。冷冻干燥速溶藏茶对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的IC50分别为0.247、0.417 mg/mL，喷雾干燥速溶藏茶对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的IC50分为0.339、0.443 mg/mL，冷冻干燥的速溶藏茶抗氧化效果好于喷雾干燥。本研究开发的速溶藏茶能为下一步速溶藏茶产品工业化生产提供理论依据，对助推雅安藏茶产业发展具有重要意义。