鸭胸肌肌内脂肪含量全基因组关联分析

刘文静，凡文磊，刘大鹏，赵金山，周正奎*，侯水生*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

我国是鸭肉生产和消费大国，鸭存栏量和消费量约占全球的75%[1]。北京鸭肌内脂肪含量为4%～6%[2]，肉质极为鲜嫩。脂肪包含多种脂肪酸，会影响肉的风味、pH、嫩度和多汁性[3]。为探究影响肌内脂肪沉积的遗传机制，Ge 等[4]和徐思雨[5]分别利用巢湖鸭和麻鸭鉴定COMT、NT5E、PDE4D、PLA2G4F、A-FABP和CIDEa、FAS、ATGL基因与肌内脂肪相关。诸多研究报告均表明肌内脂肪沉积受基因调控[4,6]，但影响该性状的主效基因和遗传机制仍需进一步挖掘和验证。

随着高通量基因分型技术的发展，全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）[7]得到更广泛应用，可以更精准定位影响复杂性状的基因。Cho等[8]结合GWAS 和连锁不平衡分析鉴定出MYH3基因的一段功能性调控序列变异影响猪肌内脂肪积累；其他研究者也在牛[9-10]和鸡[11-12]等物种上鉴定出影响肌内脂肪沉积的相关基因，如FABP、MC4R、FAS、ELOVL5、FASN和CASP2等。为找到影响鸭胸肌肌内脂肪沉积的关键基因，本实验以北京鸭× 野鸭F2代资源群体为研究材料，测定胸肌肌内脂肪含量并进行GWAS 分析，鉴定影响鸭胸肌肌内脂肪的相关基因及其遗传机制，为改良鸭胸肌肉质提供有效的分子标记。

1 材料与方法

1.1 实验动物和样品采集 本研究实验材料是由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地种鸭保种场提供。于2015 年以北京鸭（41 只，8 ♂、33 ♀）和绿头野鸭（28 只，4 ♂、24 ♀）为F0代进行正反交构建的F2代资源群体，在相同环境和饲粮条件下饲养至8 周龄，在相同的环境条件下进行屠宰。本研究随机抽取130 只F2代（66 ♂、64 ♀）用于测定其肌内脂肪含量。

1.2 鸭胸肌肌内脂肪含量的测定 本实验利用索氏提取法[13]测定肌内脂肪含量。样品用真空冻干机[14]获得肉粉末供后续检测。每个样品称取3 个对照，105℃烘干4 h。1 份用于检测肉样中残留的水分初始鲜重m2、绝干重m3。剩余2 份平行样本用于测定肌内脂肪含量，初始鲜重为m4，用无水乙醚70℃连续抽提8 h 烘干后质量为m5。实验用滤纸包相同条件烘干后质量为m1。使用差减法测得肌内脂肪含量，计算公式：m=m4-（m5+m1）+（m2-m3），其中m 为样品（绝干）肌内脂肪含量。

1.3 遗传力估计及与性状相关性

1.3.1 鸭胸肌肌内脂肪遗传力估计 本研究利用MTDFREML[15-17]即多性状非求导约束最大似然法，采用动物模型，确定固定效应和随机效应建立混合线性模型，计算胸肌肌内脂肪性状的遗传力。模型如下：

其中，y为肌内脂肪含量表型值；Z为随机效应结构矩阵；a为随机效应向量；X为固定效应结构矩阵，其中固定效应包括养殖环境、育种方式、性别；b为固定效应向量；e为随机残差效应向量。

1.3.2 性状相关性 利用R 包Hmisc[18]程序计算其他肉质性状（胸肌厚、胸肌重、肉色b*、肌纤维面积和肌纤维直径[19]）与肌内脂肪含量间的皮尔逊相关及显著性并用PerFormanceAnalytics 绘制图形进行数据可视化。

1.4 重测序及分析

1.4.1 基因组重测序 动物屠宰前静脉采血，用酚-氯仿法提取全血DNA[20-21]，使用NanoDrop-2000 和琼脂糖凝胶电泳对DNA 质控后重测序和建库[20]。每个个体的重测序数据量不少于5 Gb。用FAST QC version 0.10.1 软件对clean reads 进行质量控制，后用BWA version 0.7.17 软件将质控后得到的reads 比对到北京鸭参考基因组（GCA_003850225.1）上。用Picard 软件将重复比对的reads 移除后用GATK version3.6 软件的再比对功能，增强插入缺失变异区域的比对准确性。使用GATK 软件进行SNP 和插入缺失的鉴定和分析。同时用PLINK 软件[22]将参数设定为最小等位基因频率MAF＞0.05，个体基因型缺失率＞0.1，以及哈代-温伯格平衡P＜1×10-6，找出连锁较强的区域范围。

1.4.2 全基因组关联分析及群体遗传结构分析 使用EMMAX version beta[23]软件中的混合线性模型，对肌内脂肪含量表型值与全基因组SNP 进行GWAS 分析，同时进行Q-Q plot 检验。分析模型为：

其中，y为肌内脂肪含量表型值；u为脂肪含量表型值的平均值；X为固定效应矩阵，其中固定效应包括养殖环境、育种方式、性别；b为固定效应向量；G为F2群体亲缘系谱的遗传矩阵；e是脂肪含量表型值的随机残差。

采取BonFerroni 方法确定阈值。利用EIGENSOFT软件中的SMARTPCA 模块对该性状进行主成分（Principal Components Analysis，PCA）分析。

2 结果

2.1 鸭胸肌肌内脂肪相关及遗传力估计 本实验发现，鸭胸肌肌内脂肪含量在2%～7.5%，平均含量为4.8%且服从正态分布（图1）。其中，61%的个体肌内脂肪含量在4%～6%，24%的个体肌内脂肪含量小于4%，13%的个体肌内脂肪含量大于6%。由图2 可知，2 个主要成分对肌内脂肪积累影响效果较明显，分别贡献28%和20% 的影响效力。该实验群体也未出现明显的群体分层或其他亚群结构，表明群体结构的稳定性。此结果与后续分析结果相结合，说明本次分析没有因群体分层而出现假阳性，基于线性模型的全基因组关联分析可靠。

图1 鸭胸肌肌内脂肪含量正态分布

图2 肌内脂肪相关SNP 的主成分分析

对肌内脂肪含量和其他性状进行相关分析发现，肌内脂肪与b*肉色存在较弱的相关性（图3），与胸肌厚和胸肌重的相关性最强，相关系数r分别为0.57 和0.36；与肌纤维面积和直径也存在较强的相关性，相关系数r分别为0.44 和0.42。使用MTDFREML 软件中的动物模型进行遗传力估计，在遗传方差、环境方差和表型方差分别为0.103、0.161 和0.264 时，估计肌内脂肪含量的遗传力h2为0.39，具有中等遗传力。

图3 肌内脂肪与其他性状相关性

2.3 脂肪含量的GWAS 结果分析 将肌内脂肪含量的表型数据比对到全基因组进行关联分析（图4），检测影响肌内脂肪含量的遗传变异相关的基因位点，共得到7 202 864 个有效SNP 位点，其中有9 个有效SNP达到染色体水平显著（P＞-log（1/SNP）），与肌内脂肪含量显著相关，分别位于1 号染色体、8 号染色体和16 号染色体。这些显著SNP 一部分坐落于NEGR1、FBRSL1、FPGT、ZRANB2、PTGER3、CTH、ANKRD13C、SRSF11、LRRC40、LRRC7基因。

图4 鸭胸肌肌内脂肪含量GWAS 分析曼哈顿图和QQ-plot

因在1 号染色体和8 号染色体最高点SNP 与基因座的相关性较强，所以计算最高点SNP 与周围SNP 之间的成对连锁不平衡（LD）。根据相关性R2值大小将位于1 号染色体的致因变异区域缩小到4.20～4.38 Mb的0.18 Mb（R2＞0.4）（图5）。在这个区域的最高点SNP 处的基因型如图6 所示（-log10P=6.94）。该点表型均值与基因分型存在等位基因差异，TT 基因型对应的肌内脂肪平均含量较CC 和CT 基因型更高，推断随着等位基因T 的出现表达水平增高，TT 基因型为群体中脂肪代谢的优势基因型。

图5 鸭胸肌肌内脂肪含量1 号染色体表型与基因型对应的连锁不平衡分析

图6 不同染色体关联性最强点的基因分型与表型分布差异

将8 号染色体致因变异区域缩小到5.0～5.6 Mb 的0.6 Mb 的区域内（图6），对该区域进行基因分型发现不同表型值存在等位基因差异性（-log10P=7.71，图7）。通过基因注释文件发现FPGT、NEGR1、ZRANB2、PTGER3、CTH、LRRC40、ANKRD13C、SRSF11、LRRC7等9 个基因。根据8 周龄鸭器官组织转录组[24]基因表达情况，发现基因FPGT在不同组织器官间存在表达差异（图8），该基因在胸肌、脑和皮的表达相对其他组织器官较高，且在胸肌中的表达随个体日龄的增加呈现不同变化趋势。

图7 鸭胸肌肌内脂肪含量8 号染色体表型与基因型对应的连锁不平衡分析

图8 FPGT 在不同组织器官中的差异表达

将位于16 号染色体的致因变异区域缩小到3.4～3.6 Mb的0.2 Mb 区间内（图5）。该区间最高点SNP 出现明显的基因分型（-log10P=8.64，图8）且表型均值随等位基因C 的表达呈现升高趋势。

3 讨 论

图9 鸭胸肌肌内脂肪含量16 号染色体表型与基因型对应的连锁不平衡分析

图10 位于16 号染色体关联性最强点的基因分型与表型分布差异

长期以来，为满足人类营养需求，研究人员在改善肉质方面做了大量工作，其中改善肌内脂肪含量是肉品质研究的主要方向。研究发现，猪肉中肌内脂肪含量下降影响肉嫩度，同时使肉的系水力下降，对肉品质造成明显影响[25]。Cho 等[8]利用GWAS 和连锁不平衡分析发现MYH3基因对调控肌内脂肪含量的基因（CD36、LPL、FABP4、FTO、ADIPOQ）表达有影响。Madrid等[26]利用200k SNP 芯片鉴定出影响兔肌内脂肪含量的基因EWSR1，该基因影响褐色脂肪细胞的生成和积累。Wang 等[27]、Lee[28]和Wang 等[29]分别研究了三黄鸡、伯克郡猪和肉鸡中不同亚型FABP基因对动物机体脂肪积累的影响。本研究借鉴前人关于肌内脂肪的测定和分析，旨在鉴定影响鸭胸肌肌内脂肪的候选基因。

胸肌是鸭肉产品的主要部分，本实验选130 只北京鸭×野鸭F2代个体，发现胸肌肌内脂肪含量与胸肌厚具有较高的相关性（r=0.57），表明肌内脂肪的积累对胸肌厚度有重要影响。同时，估计肌内脂肪含量的遗传力为0.39，属于中等遗传力，表明该表型变异很大程度上受遗传调控。在家禽中关于肌肉脂肪遗传力的报道相对较少。陈继兰等[30]报道了北京油鸡公鸡的胸肌肌苷酸和肌内脂肪含量遗传力分别为0.23 和0.10，属中等偏低遗传力性状。Won 等[31]报道伯克希尔猪的肌内脂肪遗传力为0.52，属于高等遗传力，与本实验结果不同的原因是家禽与家畜肌内脂肪积累存在生理差异[32]，家禽的肌内脂肪沉积大多由腹脂转化而来，并不是由原始的肌肉脂肪细胞增值分化而来，因此其肌内脂肪遗传力较低。本研究中所用实验材料为北京鸭和野鸭的F2代，不同物种采食情况、运动状况和遗传机制存在较大差异，因此本实验结果与前人[31]在北京油鸡上的研究结果存在较大差异。

本实验利用GWAS 和连锁不平衡，鉴定影响肌内脂肪的相关染色体区域。其中在1 号染色体的0.18 Mb（R2＞0.4）区域与肌内脂肪关联性较强，达到染色体显著水平。在1 号染色体的0.18 Mb 区域最高点SNP 4 295 308 bp 处进行基因分型发现，TT 基因型的肌内脂肪平均含量明显高于CC 和CT 基因型，说明TT 基因型为优势基因型。在8 号染色体的0.6 Mb 区域内包含的9 个基因中，FPGT基因在不同组织存在表达差异，其中在胸肌、脑和皮的表达较高，在胸肌中随个体日龄的增加出现表达增高或降低的趋势。Quirk 等[33]报道，FPGT基因编码的蛋白质参与由糖蛋白和糖脂转换为L-岩藻糖的补救途径，增加糖蛋白和糖脂的利用，是糖类和脂肪转化的关键基因。TriFonova 等[34]研究发现FPGT基因与体重指数超标或肥胖有关。NEGR1基因调控胰岛素和胆固醇的代谢，胆固醇代谢异常影响脂肪的沉积，在儿童[35]和小鼠[36]均表现出与机体肥胖症相关。在16 号染色体的0.2 Mb 区间最高点SNP 进行基因分型，发现CC 基因型对应的肌内脂肪均值明显高于AA 和AC 基因型，推测等位基因C 可能与脂肪代谢某种途径相关。该研究得到的区间位点及其相关的基因还需要进一步的确定和验证，对阐明脂肪代谢调节过程提供一定的参考价值。

综上可知，鸭胸肌肌内脂肪是一个由多基因控制且遗传机制复杂的数量性状。由于本实验样品数量有限，一定程度上影响结果分析的准确性，但结合其他参考文献和实验设计，本研究定位的显著性区域对后续研究该性状并阐明其遗传机制仍具有参考价值，为后续分析验证提供新的思路和方向。

4 结 论

本实验对北京鸭×野鸭F2代鸭胸肌肌内脂肪含量分析，发现肌内脂肪含量与胸肌厚、肌纤维面积和直径具有较强的相关性，且肌内脂肪含量具有中等遗传力。对肌内脂肪含量性状进行GWAS 和连锁不平衡分析发现9 个SNP 与肌内脂肪显著相关，共发现FPGT、NEGR1、PTGER3、CTH等9 个基因，通过基因注释发现FPGT和NEGR1基因均与动物机体体重指数超标或者肥胖相关，推测其可能影响脂肪的积累，同时影响鸭胸肌肌内脂肪含量。