低蛋白日粮补饲过瘤胃蛋氨酸、亮氨酸及异亮氨酸对后备牛生长及消化性能的影响

冯 蕾，李国栋，王中华，胡志勇

（山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018）

后备牛阶段为奶牛生长发育阶段的总称，是指从出生至第1 次产犊前的奶牛[1]。现代化奶牛养殖中，由于后备牛在产犊前不能为牛场带来经济效益，但生理成熟期与其体重相关[2-3]，生产中常通过饲喂高营养高蛋白水平日粮，提高其日增重以期更早达到配种体重，但我国饲料资源紧缺，尤其是蛋白质类饲料原料供不应求[4]，导致蛋白饲料价格居高不下；同时由于奶牛生理消化特点导致蛋白利用率低，摄入的蛋白大量通过粪尿排出体外，日粮氮平均泌乳转化效率仅为24.7%，降低氮摄入会降低粪尿中氮排泄量[5]，因此降低后备牛日粮蛋白水平的饲养模式需要深入研究。部分氨基酸参与代谢调控，在反刍动物日粮中以过瘤胃保护形式添加此类氨基酸，可适当降低日粮蛋白水平而不影响生产性能，可提高日粮氮转化效率、减少粪尿氮排放[6]。蛋氨酸（Met）作为一种必需氨基酸，可促进蛋白质合成并对免疫功能有重要作用[7]。亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路促进肌肉蛋白质合成[8]。在奶牛饲养中，补充氨基酸对生长发育、消化代谢、激素调节具有积极效果。目前，低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸的相关研究主要集中在泌乳奶牛，在后备牛上鲜有报道。本研究在后备牛饲养中应用低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸，以期饲喂更少的蛋白饲料以获得较好的生长速度，减少氮排泄，降低对环境的污染，为后备牛营养研究和生产提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 过瘤胃蛋氨酸（RPMet）：包被率60%，过瘤胃率85%，小肠释放率99%；过瘤胃亮氨酸（RPLeu）：包被率70.6%，过瘤胃率86.4%，小肠释放率98.3%；过瘤胃异亮氨酸（RPIle）：包被率70.3%，过瘤胃率87.2%，小肠释放率98.1%。过瘤胃氨基酸包被率为产品有效含量，所有包被氨基酸由杭州康德权饲料有限公司提供。

1.2 试验设计和日粮 试验采用随机区组设计，选取平均日龄为（211.5±1.5）d、初始体重为（219.6±5.8）kg的荷斯坦后备母牛40 头，按照体重、日龄相近原则随机分为5 组，每组8 头。高蛋白日粮为正对照组（HP 组），日粮粗蛋白质含量14.6%；低蛋白日粮为负对照组（LP组），日粮粗蛋白质含量11.6%；低蛋白日粮+RPMet（LP+M）组；低蛋白日粮+RPIle 和RPLeu（LP+IL）组；低蛋白日粮+RPMet、RPIle 和RPLeu（LP+MIL）组。试验日粮参照美国NRC（2001）标准配制，试验日粮组成与营养成分见表1。

表1 日粮组成及营养成分（干物质基础）

根据NRC（2001）预测每种日粮小肠可消化氨基酸含量（表2）。实际过瘤胃氨基酸的添加量根据产品包被率、瘤胃降解率和小肠释放率计算得到（表3），添加于全混合日粮（TMR）。

表2 根据NRC（2001）预测的小肠可消化必需氨基酸流量 g/d

表3 过瘤胃氨基酸的实际添加量（干物质基础） %

1.3 饲养管理 预试期10 d，正试期30 d。试验期间各组牛的日粮营养水平保持不变，根据试验牛体重和剩料情况，每10 d 调整一次，TMR 每天饲喂2 次，保证采食后食槽中饲料略有剩余，单独记录每头牛的采食量，自由饮水。

1.4 样品采集

1.4.1 饲料样品采集 在正试期第30 天的前3 d（试验末期），每天记录每头奶牛的饲料采食量及剩余量。每次采集的剩料样品按剩料各成分鲜重比例混匀。所有样品于65℃烘干测定初水分，粉碎至1 mm，密封保存于-20℃，备用。饲料及剩料样品105℃下测定干物质（DM）。

1.4.2 血样采集 在正试期第30 天晨饲前采集尾根静脉血10 mL，立即注入促凝管中，置于37℃水浴锅中0.5 h，静置后，3 500 r/min 离心15 min，收集上层血清分装至1.5 mL 离心管，做好标记，-20℃冰箱冷冻保存，待测血清激素生化指标。

1.4.3 粪样与尿样采集 在正试期第30 天的前3 d 采用点采样法[10]采集粪、尿。尿液采集用阴门按摩刺激法，收集中游尿液20 mL，将尿样与0.072 N 的H2SO4按照1:4 的比例迅速混合固氮。将3 次采集样品等量混匀，于-20℃冰箱保存，待测CP、肌酐。粪样采用直肠取粪法，按比例混合，65℃烘至恒重并粉碎至1 mm，待测DM、CP、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、灰分（Ash）、酸不溶灰分（AIA）。总尿液量、总排粪量分别通过Cre[11]、AIA[12]作为内源指示剂进行计算而得。

其中，A1 为投料量（kg）；B1 为投料的AIA 比例（%）；A2 为剩料量（kg）；B2 为剩料的AIA 比例（%）；C为粪中AIA 比例（%）。

其中，CE 为理论后备牛每天Cre 排泄量（mmol）；D为尿液中Cre 浓度（mmol/L）；BW 为后备牛体重（kg）。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 过瘤胃氨基酸 过瘤胃氨基酸包被率由杭州康德权饲料有限公司提供；过瘤胃率测定选用3 头约650 kg装有瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，根据奶牛营养需要和饲养标准，参照NRC2001 标准配制常规饲料，自由饮水，试验方法和瘤胃降解率的计算参照Yu 等[13]方法；小肠释放率通过收集在瘤胃中培养16 h 后的饲料残渣，应用改进三步体外法[14]测定。

1.5.2 日粮营养成分 样品中DM、CP、NDF、ADF、Ash、钙（Ca）和磷（P）的测定均采用国家标准方法[15-21]。

1.5.3 生长发育指标 在正试期第30 天晨饲前测量每头牛的体重、体尺。测量时保持奶牛端正站立在平坦场地上，四肢直立，从后面看后腿掩盖前腿，侧望左腿掩盖右腿。头自然前伸，不左右偏，不高抬或下俯。四蹄落在地面呈两条平行直线。体高为奶牛个体十字部最高点至水平地面的垂直高度。体斜长为奶牛肩胛骨前缘至坐骨结节后缘的距离。胸围为奶牛肩胛骨后角（肘突后缘）处量取的胸部周径。

1.5.4 血清生化指标 使用全自动生化分析仪（日立，Type 7020）对血清生化指标进行测定。测定的生化指标及激素主要包括葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、尿素、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、碱性磷酸酶（ALP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）。

1.5.5 血清中激素 胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLN）、胰岛素样生长因子-I（IGF-I）、生长激素（GH）、催乳素（PRL）、促黄体生成素（LH）、孕酮（P）、雌二醇（E2）由泰安市中心医院进行放射性免疫法测定。

1.5.6 尿样中Cre 尿液中Cre 采用肌氨酸氧化酶法试剂盒（南京建成生物科技有限公司），使用CMax Plus微孔板读板机进行分析。

1.6 统计分析 采用SAS 9.2 统计软件中GLM 过程进行统计，Duncan's 法进行多重比较。P＜0.01 为差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，0.05 ≤P＜0.1 表示差异有统计学上的趋势。试验结果以平均值和均值标准误（SEM）表示。

2 结果

2.1 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对后备牛生长性能的影响 由表4 可知，低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对各组间的后备牛体斜长、体重、体高、胸围无显著差异；HP 组平均日增重（ADG）显著高于LP 组（P＜0.05），LP+IL、LP+MIL 组的ADG 高于LP 组（0.05 ≤P＜0.1）。LP+IL、LP+MIL 组每千克增重所消耗蛋白量低于LP+M 组（0.05 ≤P＜0.1）。

表4 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对后备牛体重、体尺、ADG 的影响

2.2 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对后备牛血清生化指标及激素含量的影响 由表5 可知，组间血清尿素含量差异极显著，HP 组高于LP 组（P＜0.01），LP+IL 和LP+MIL 组与LP 组无显著差异。各组的ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLU 及TG 均差异不显著。LP+MIL组的GLN 含量低于其余组（P＜0.01）；各组血液中的PRL、GH、LH、INS、P、E2及IGF-I 含量均差异不显著。

表5 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对血液生化指标及激素含量的影响

2.3 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对后备牛营养成分表观消化率的影响 由表6 可知，各组间的总干物质采食量差异不显著，HP 组的CP 采食量高于LP 组（P＜0.01）。LP+IL 组的NDF 采食量小于LP 组（0.05 ≤P＜0.1），LP+IL 组ADF 采食量低于其余组（P＜0.01）。各组间的总干物质、CP、ADF 和NDF，各营养物质的粪中含量、表观消化率差异不显著。

表6 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对营养物质表观消化率影响

2.4 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对氮平衡的影响 由表7 可知，HP 组的摄入氮高于LP 组（P＜0.05），LP+IL 组低于LP 组（P＜0.01）。组间的尿氮的排出量差异极显著。LP 组尿氮占摄入氮的百分比低于HP、LP+M 组（0.05 ≤P＜0.1）。HP 组的消化氮高于其余组（P＜0.01）。LP 组保留氮高于HP、LP+M 组（P＜0.05），与LP+IL、LP+MIL 组无显著差异。组间的粪氮、氮表观消化率差异不显著。

表7 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对氮消化代谢的影响

3 讨 论

3.1 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对后备牛生长性能的影响 本试验条件下，各组间的体斜长、体高、胸围、体重无显著差异，说明11.6%CP 日粮中添加RPMet、RPLeu 和RPIle 不会对7 月龄后备牛体尺产生消极影响，与孔凡林等[22]、崔秋佳等[23]研究结果一致。LP+M 组与HP 组和LP 组每千克增重所消耗蛋白量无显著差异，而LP+IL 组和LP+MIL 组有低于LP+M 组的趋势，在LP 组日粮基础上补充Met 对7 月龄的后备牛每千克增重所消耗蛋白的量影响不是很大，各营养成分的采食量随犊牛生长提高，Met 作为一碳单位供体的功能被胆碱[23]等部分取代，牛只对Met 敏感性逐渐降低，11.6%CP 日粮可以满足其Met 需求。Met 被认为是促进动物生长的氨基酸[24]。桑丹等[25]研究表明，Leu、Ile 可以通过对mTOR 信号传导通路的影响促进骨骼肌蛋白质合成。本试验发现，HP 组的ADG 高于LP 组，LP+MIL 组与HP 组的ADG 差异不显著，但高于LP+M 组，说明降低蛋白水平并添加RPMet、RPLeu和RPIle 不会降低生长性能，体重增长差异小，且比单个添加氨基酸效果更显著。有研究显示，Leu 可以改善胰腺外分泌功能，可以增加反刍动物小肠对营养物质的消化[26]。这可能解释了LP+MIL 和LP+IL 组的ADG水平较高。

3.2 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对后备牛血清指标的影响 血清尿素含量是反映机体蛋白质氮代谢和日粮氨基酸平衡状况的重要指标，易受日粮蛋白质含量、氨基酸组成与瘤胃降解能力影响[27]。奶牛日粮蛋白质在瘤胃转化过程中，多余氨通过肝脏脱氢转化为尿素排出体外，血清尿素是机体蛋白质代谢最终产物[23]。本试验中HP 组尿素浓度显著高于LP 组，说明蛋白质采食量多，尿素含量也会增加，尿素浓度随日粮蛋白水平升高而升高；HP 组尿素水平显著高于其余组，说明HP 组蛋白质沉积率和合成效率低于其他各组，造成饲料资源浪费。LP+M 组尿素水平显著高于LP+IL 组，且有高于LP+MIL 组的趋势，7 月龄后备牛饲喂低蛋白日粮基本可以满足Met 需求，在LP 组日粮基础上添加Met 被利用沉积的效果较Leu 和Ile 更差。

3.3 低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸对营养物质表观消化率的影响 有研究报道，蛋白质和氨基酸缺乏导致干物质采食量（DMI）降低[28]。本试验结果表明，蛋白水平对总DMI 无影响，而且本试验LP 组保留氮显著高于其他组，表明11.6%的低蛋白水平没有造成蛋白缺乏，且11.6%CP 水平下氮利用更高效，减少资源浪费。蛋白水平对CP 采食量产生影响，但粪中CP 含量与表观消化率组间无显著差异，HP 组尿氮显著高于其余组，说明降低日粮蛋白水平可以显著降低排氮量，HP 组摄入的蛋白质会通过尿氮排出体外，污染环境。LP+M 组的尿氮占摄入氮的百分比显著高于LP 组，而LP+IL、LP+MIL组与LP 组差异不显著且低于HP 组，说明Met 可能促进了尿氮排放，LP+IL、LP+MIL 组日粮氮的转化效率较HP 组有一定提高，具体原因与机理仍需进一步研究。在数值上，LP 组的CP 采食量最低，添加RPMet、RPLeu 和RPIle 未对CP 采食量产生显著影响。消化率是可消化营养物质占摄入饲料营养物质的百分率[29]。本试验结果表明，低蛋白日粮中添加3 种过瘤胃氨基酸对DM 和各种营养成分的表观消化率及粪中含量无显著影响，并未提高后备牛饲喂效率，可见后备牛消化系统已发育完全，与孔凡林等[24]研究结果一致。本试验中，NDF、ADF 采食量组间显著差异。Silva 等[30]报道，随机体的发育成熟，12 月龄后备牛的挑食行为比4 月龄更显著，表现为喜食精料、厌食粗料，CP 采食量增加，NDF 采食量下降。NDF 采食量低可以认为采食更多精料，然而本试验条件下低蛋白日粮中苜蓿是主要的蛋白来源，挑食意味苜蓿采食量减少，CP 摄入量的减少，LP+IL 组的氮摄入量显著低于其余各组，可能是由于该组牛挑食情况最严重导致，LP+ILM 组的NDF 采食量与HP 组无显著差异，这提示低蛋白日粮添加RPMet、RPIle、RPLeu 的联合作用促进了食欲，减少了挑食行为，机制可能为下丘脑mTORC1 通路在调控食欲调节基因表达中起关键作用，其作为感应器感应日粮氨基酸的变化，影响了食欲调节基因表达，从而调节采食量[31]。同样解释了LP+MIL 组血清尿素水平高于LP 组。

4 结 论

本试验结果表明，在玉米-豆粕型基础日粮下，7月龄后备牛饲喂低蛋白日粮添加过瘤胃氨基酸的日粮1个月对DMI、各营养成分消化率没有影响，但一定程度上提高了日粮氮的转化效率。对于生长性能来说，日粮蛋白质水平降低3 个百分点并补充RPMet、RPLeu、RPIle，共同添加比单个添加的效果更为明显。