不同皮渣浸渍发酵时间对葡萄酒中缩合单宁构成及感官品质的影响

丁 燕，Roland HARRISON，王超萍，陈迎春，韩晓梅，吴新颖,*

（1.山东省葡萄研究院，山东济南 250100；2.山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心，山东济南 250100；3.新西兰林肯大学葡萄酒食品及分子生物学系，新西兰坎特伯雷 7647）

缩合单宁（Condensed tannins）又称原花色素（Proanthocyanidins，PAs），主要是以黄烷-3-醇为基本单元，通过C4-C8或C4-C6共价键连接而成的多聚体，其中根据黄烷-3-醇单元B 环羟基数目的不同和C 环3-羟基结构的不同，主要可分为儿茶素（CAT）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）等，其酚羟基基团能与蛋白质、金属离子、花色苷、多糖等结合[1-3]。作为葡萄与葡萄酒中一类重要的多酚物质，其含量、结构、聚合度、没食子酰化度等对葡萄酒感官特性，如色泽、澄清度、酒体、苦涩味等以及稳定性、陈酿潜力等都具有直接或间接的影响[4-5]。

葡萄酒中的缩合单宁主要来源于葡萄皮和种子，发酵过程中通过皮渣浸渍作用等进入葡萄酒中。葡萄原料中的缩合单宁的含量、聚合度、结构等会因葡萄品种、不同组织部位、葡萄成熟度等而有差异，如葡萄皮缩合单宁中含有原花青靛（Prodelphinidins，PDs），而种子中则没有；葡萄皮缩合单宁的平均聚合度（mDP）一般为20，而种子中的平均聚合度一般为5～8；葡萄皮中缩合单宁构成单元主要由CAT、EC、ECG、EGC 等组成，而葡萄种子中则主要由CAT、EC、ECG 等组成[6-7]。研究人员曾利用不同的分析方法对不同品种葡萄果实中的缩合单宁进行过测定，研究结果表明，葡萄收获时果实中的缩合单宁含量并不能代表最终能浸提到葡萄酒中的缩合单宁水平[8-9]，因为除了葡萄原料之外，酿造过程中发酵温度、皮渣浸渍时间、低温预发酵工艺、皮汁比调整、浸渍酶添加等不同的酿酒工艺，都会影响成品葡萄酒中酚类物质的含量以及组成[10-11]，研究酿造工艺对最终葡萄酒产品中缩合单宁的组成和含量具有重要的意义。基于此，本文主要通过探究葡萄皮渣浸渍时间对葡萄酒中缩合单宁的组成以及感官品质的影响，以期对葡萄酒酿造工艺的改进有所助益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒葡萄赤霞珠、西拉 于2017 年4 月采自新西兰林肯大学葡萄种质资源圃，每个品种选取20 株葡萄，每株葡萄随机选择葡萄穗，在葡萄穗的不同部位摘取5～10 粒葡萄，共摘取大约600 g 葡萄粒，分成3 份保存；酵母Lalvin D254 法国拉曼公司；亚硫酸 帝伯仕公司；丙酮、甲醇、乙腈、甲酸、乙酸HPLC 色谱级，美国Fisher 公司；（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素、（-）-表棓儿茶素、（-）-表棓儿茶素没食子酸酯、三氟乙酸、抗坏血酸、醋酸钠 美国Sigma-Aldrich 公司；Toyopearl HW-50（F）日本Tosoh 公司；实验用水 超纯水（电导度18 M）。

Waters 2695 高效液相色谱仪、Waters 2996 光电二极管阵列检测器（PDA）美国Waters 公司；Multifuge X1R 台式高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher 公司；Eyela N 1100 旋转蒸发仪 日本Eyela 公司；Labconco Centrivap 真空离心浓缩仪美国Labconco 公司；Christ Alpha 1-4 LSC plus 冷冻干燥机 德国Christ 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同皮渣浸渍发酵工艺 参考李华等[12]的工艺流程。酿酒葡萄→除梗破碎→葡萄浆→添加亚硫酸（60 mg/L）→添加酵母（200 mg/L）→ 25 ℃浸渍发酵（皮渣浸渍7、14、21 d，期间每天压帽2～3 次）→皮渣分离（1.5 bar 压榨）→自流汁与压榨汁混合进入后酵（25±1 ℃）→待还原糖降至2 g/L 时发酵结束→倒罐→下胶澄清（皂土，添加量通过试验确定，参考用量0.3～0.6 g/L）→纸板过滤→充氮气低温储存（12～15 ℃）。

1.2.2 葡萄皮和籽中缩合单宁的分离 参考Kennedy等[13]的方法，并稍作修改。取10 粒葡萄，称重，手动分离葡萄皮和种子，用双蒸水冲洗。分别放入具塞离心管中，加入1 mL/g 粒重的丙酮:水（3:2，v/v）提取液，室温避光振荡提取24 h。提取液低温离心15 min（8000 r/min，4 ℃），上清液进行真空旋蒸，冻干成粉。用1 mL 甲醇重溶，置于2 mL 棕色样品瓶中，-20 ℃冷冻保存备用。所有取样和分析均3 次重复。间苯三酚酸催化降解反应：取100 μL 甲醇重溶液，加入100 μL 间苯三酚反应试剂，50 ℃水浴反应20 min 后，加入400 μL 0.2 mol/L 醋酸钠溶液，终止反应。间苯三酚反应试剂的配制：0.2 mol/L 盐酸甲醇溶液，含100 g/L 间苯三酚和20 g/L 抗坏血酸。

1.2.3 葡萄酒中缩合单宁的分离 参考Pastor 等[14]的方法，并进行适当优化。取5 mL 葡萄酒样品，真空浓缩仪浓缩，用3 mL 水:乙酸（98:2，v/v）重溶，上Waters C18固相萃取小柱。样品完全吸附后，用20 mL水:乙酸（98:2，v/v）洗柱，再用10 mL 甲醇洗脱，得到的甲醇洗脱液进行真空旋蒸，冻干成粉。用1 mL甲醇重溶，置于2 mL 棕色样品瓶中，-20 ℃避光保存备用。间苯三酚酸催化降解反应同1.2.2。

1.2.4 缩合单宁的HPLC 分析条件 HPLC 分析方法参考Ducasse 等[15]的方法，并稍作修改。Waters Atlantis dC18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱，Waters 保护柱（20 mm×4.6 mm，5 μm），紫外检测波长为280 nm，柱温30 ℃，进样量为10 μL，流速为0.8 mL/min。梯度洗脱：流动相A：水：甲酸（98:2，v/v），流动相B：乙腈：流动相A（80:20，v/v）。洗脱程序：0～5 min，0 B；5～35 min，0～10% B；35～70 min，10%～20%B；70～75 min，20%～100% B；75～80 min，100%～0 B。缩合单宁构成单元根据保留时间以及参考已报道的资料文献进行定性[13]，并以（+）-儿茶素（CAT）为标准进行外标法定量，相关计算参考文献[7,13]的方法。

1.2.5 感官分析 由10 名品酒员组成品评小组，在正式感官评定前，先用酒石酸、硫酸奎宁、硫酸铝等配制不同浓度的模拟酒液，分别进行酸味、苦味、涩味的品评训练。然后再对不同浸渍时间处理的葡萄酒样品进行感官品评分析，主要对酒样的酸度、涩度以及苦味进行评价和描述，采取8 分制，8 分表示强度最高。根据定量描述分析结果绘制蛛网图。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 18.0 统计软件分析。通过邓肯检验和ANOVA 方差分析法进行变量间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种葡萄原料中缩合单宁组成及含量

葡萄原料中的缩合单宁含量会直接影响葡萄酒中的浓度。从表1 可以看出，赤霞珠葡萄皮中缩合单宁含量大约为9.42 mg/g 皮，显著（P＜0.05）高于西拉葡萄皮中的含量（5.32 mg/g 皮）；百克鲜重含量大约为80.92 mg/100 g，也明显高于西拉葡萄的44.36 mg/100 g。赤霞珠葡萄皮缩合单宁的聚合度mDP约为23.50，明显高于西拉葡萄皮的14.61，这与文献[16]的研究结果基本一致。此外，西拉葡萄皮中缩合单宁没食子酰化度（4.22%）要显著（P＜0.05）大于赤霞珠葡萄皮（2.41%）。

表1 赤霞珠和西拉葡萄皮中缩合单宁的含量及组成Table 1 Contents and composition of condensed tannins in CS and Syrah skin

从表2 可以看出，赤霞珠葡萄籽中缩合单宁含量约为24.56 mg/g 籽，略高于西拉葡萄籽中的含量20.89 mg/g 籽；2 个品种葡萄籽缩合单宁平均聚合度mDP 没有明显差异。此外，西拉葡萄种子中缩合单宁的没食子酰化度（20.65%）显著（P＜0.05）高于赤霞珠葡萄种子（15.82%）。

表2 赤霞珠和西拉葡萄籽中缩合单宁的含量及组成Table 2 Content and composition of condensed tannins in CS and Syrah seed

从表1 和表2 还可以看出，2 个品种葡萄皮缩合单宁末端单元主要是由（+）-儿茶素（CAT）组成，其次是（-）-表儿茶素（EC）；而延伸单元则主要是由（-）-表棓儿茶素（EGC）组成和（-）-表儿茶素（EC）主导组成，这与文献[8]研究结果一致。2 个品种葡萄籽缩合单宁末端单元均主要由（+）-儿茶素（CAT）、（-）-表儿茶素（EC）组成，其次是（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG），而延伸单元则主要由（-）-表儿茶素（EC）组成，其次是（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG），不含有（-）-表棓儿茶素（EGC）延伸单元，这与文献[13]研究结果一致。从表1 与表2 中还可以看出，葡萄籽缩合单宁含量显著（P＜0.05）高于葡萄皮中的含量；葡萄皮缩合单宁的平均聚合度mDP 显著（P＜0.05）高于葡萄籽，而其没食子酰化度则显著（P＜0.05）低于葡萄籽缩合单宁。

2.2 皮渣浸渍时间对缩合单宁的影响

从表3 中可以看出，皮渣浸渍时间对不同品种葡萄酒中缩合单宁的组成及含量都有明显影响，随着浸渍时间的延长，缩合单宁的总含量呈上升趋势。

表3 不同浸渍时间处理赤霞珠和西拉葡萄酒中缩合单宁组成及含量Table 3 Content and composition of condensed tannins in CS and Syrah wines produced with different maceration times

由表1～表3 可得，西拉葡萄原料中的葡萄皮缩合单宁含量（443.6 mg/kg 葡萄）显著（P＜0.05）低于赤霞珠葡萄皮缩合单宁含量（809.2 mg/kg 葡萄）（表1），而西拉葡萄籽缩合单宁含量（877.8 mg/kg 葡萄）也略低于赤霞珠葡萄籽缩合单宁含量（998.1 mg/kg 葡萄）（表2），但是对葡萄酒的检测结果却显示，3 个处理的西拉葡萄酒中的缩合单宁含量都比相应处理的赤霞珠葡萄酒中的含量高，这可能与不同葡萄品种的葡萄皮细胞壁的成分和组成有关系，不同品种葡萄皮细胞壁中成分的组成和含量不同会影响酚类物质的浸提率[17-19]，因此原料中酚类物质含量高的葡萄品种，其酒中的多酚含量不一定高，这可能是葡萄酒中缩合单宁含量与葡萄原料中的缩合单宁含量不同的原因。

从表3 中还可以看出，随着浸渍时间的延长，2 个品种葡萄酒中缩合单宁平均聚合度mDP 均呈明显下降趋势，这可能是由于浸渍初期缩合单宁主要是来自于葡萄皮，而随着浸渍时间的延长，葡萄籽缩合单宁的浸提量开始增加，从而使得平均聚合度mDP相应出现下降[6-8]，这一趋势与葡萄酒中葡萄皮和葡萄籽缩合单宁的含量变化趋势相符合。从表3 中看出，葡萄酒中葡萄皮缩合单宁的含量随着初期浸渍时间的延长有所上升，但到后期浸渍14 和21 d 的含量则变化不再显著，而酒中葡萄籽缩合单宁的含量则随着浸渍时间的延长而呈显著（P＜0.05）上升趋势。

如表1 和表2 所示，葡萄原料中葡萄皮缩合单宁含量显著（P＜0.05）低于葡萄籽缩合单宁含量，但从表3 来看，葡萄酒中葡萄皮缩合单宁的占比却一直显著（P＜0.05）高于种子缩合单宁的占比，而且赤霞珠和西拉葡萄中葡萄皮缩合单宁的浸提率分别为10.19%～22.78%、41.60%～63.19%，而葡萄籽缩合单宁的浸提率则分别为3.90%～9.58%、3.19%～8.32%，这可能是由于葡萄皮中缩合单宁比葡萄籽缩合单宁更容易浸提到葡萄酒中，而且品种对浸提率，尤其是葡萄皮缩合单宁的浸提率有更为显著的影响，这一结果与文献[20-22]研究结果一致。此外，葡萄原料中缩合单宁的浸提率较低，尤其是葡萄籽缩合单宁浸提率更低，除了受品种[9]及果皮细胞结构[17]的影响之外，还可能是由于葡萄破碎后葡萄皮及葡萄籽中浸出的缩合单宁会与果皮和果肉细胞壁多糖或者酵母细胞释放的甘露蛋白、多糖等发生结合，从而降低了其在葡萄酒中的定量[22-23]。

2.3 皮渣发酵浸渍时间对葡萄酒中缩合单宁相关味觉指标的影响

葡萄原料中酚类物质的含量及其在酒中与其他物质的互作反应与红葡萄酒的感官特性密切相关。从图1 和图2 中可以看出，浸渍21 d 处理的葡萄酒涩味得分较高，这可能与其中缩合单宁的浓度较高有关[24-27]。不同浸渍发酵时间处理之间酸味无显著差异；浸渍21 d 的赤霞珠葡萄酒的苦味与其他两个处理有显著（P＜0.05）差异，西拉葡萄酒3 个处理间的苦味无显著差异。由此可见，相对于苦味和酸味，浸渍时间处理对葡萄酒的涩味影响更为明显。

图1 不同浸渍发酵时间赤霞珠葡萄酒缩合单宁相关味觉指标分析Fig.1 Mouth-feel attributes related with condensed tannins in CS wines produced with different maceration times

图2 不同浸渍发酵时间西拉葡萄酒缩合单宁相关味觉指标分析Fig.2 Mouth-feel attributes related with condensed tannins in Syrah wines produced with different maceration times

3 结论

不同葡萄品种中缩合单宁的含量、组成、聚合度及没食子酰化率都有显著差异（P＜0.05）。酿酒葡萄果皮中缩合单宁的平均聚合度mDP 显著高于葡萄籽（P＜0.05），而葡萄皮缩合单宁的没食子酰化率则显著低于葡萄籽缩合单宁（P＜0.05）。葡萄皮和葡萄籽缩合单宁的组成也有所不同，其中葡萄皮缩合单宁末端单元主要是由（+）-儿茶素（CAT）组成，其次是（-）-表儿茶素（EC）；而延伸单元则主要是由（-）-表棓儿茶素（EGC）组成和（-）-表儿茶素（EC）主导组成；而葡萄籽缩合单宁末端单元均主要由（+）-儿茶素（CAT）、（-）-表儿茶素（EC）组成，其次是（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG），而延伸单元则主要由（-）-表儿茶素（EC）组成，其次是（-）-表儿茶素没食子酸酯（ECG），不含有（-）-表棓儿茶素（EGC）延伸单元。