响应面法优化紫贻贝鲜味肽酶法制备工艺

张 维，胡馨月，赵 行，刘 冰，周 振，李若敏，盘赛昆,2,3,4,

（1.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222005；2.江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏连云港 222005；3.江苏省海洋生物资源与环境重点实验，江苏连云港 222005；4.江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港 222005）

紫贻贝（Mytilus edulis），别名青口螺[1]，属贻贝科，因贝壳呈紫黑色而得名[2]，是我国常见的养殖贝类之一。贻贝含有碳水化合物、脂肪、维生素、氨基酸和微量元素等各种营养成分，是一种集营养、保健、防病于一体的海产品。紫贻贝的水解物具有抗肿瘤、降血压、降血脂、提高免疫力等作用[3-4]，具有很高的食疗与药用功效[5]。江苏省连云港海州湾海域现有贻贝养殖面积近30 万亩，产量达15 万吨。目前贻贝大多以鲜销为主，少数加工成干制品和方便食品，附加值低，很容易造成水产蛋白资源的浪费[6]。

鲜味肽是对风味特别是鲜味贡献最大的成分之一，其作为一种新型鲜味剂，具有显著的鲜味呈现[7-8]，其加工性能良好，并且具有一定的功能性，是鲜味物质研究开发的重点对象。紫贻贝肉蛋白含量高，鲜味突出，是进行鲜味肽研究的理想原料，因此对紫贻贝鲜味肽的制备研究、利用水产蛋白资源和提高调味品档次具有深远的意义。

酶解法是当前鲜味肽制备的主要方法，酶解条件温和，副产物少，选择适当的蛋白酶水解动植物蛋白制备活性肽成为研究热点[9-10]。如肖如武[11]采用复合酶水解蓝蛤肉得到的酶解液甜鲜味突出，腥味和苦味较弱，且鲜味肽富集的分子量区域比例高。赵静[12]通过蛋白酶水解辣椒粕，制备出具有鲜味突出的鲜味肽。近年来动植物蛋白肽研究在国内外有较深的研究，但对紫贻贝酶法制备鲜味肽的研究较少。

本文以江苏省连云港市海州湾海域的紫贻贝为原料，以水解度和感官评分为评价指标，通过单因素实验、Plackett-Burman 试验及Box-Behnken 中心组合试验对复合蛋白酶水解紫贻贝蛋白制备鲜味肽工艺进行筛选和优化，旨在为紫贻贝提取鲜味肽制备高档水产调味料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜紫贻贝（Mytilus edulis）江苏连云港赣榆海头镇水产品市场，洗净去壳去足丝于-20 ℃冻藏、备用；复合蛋白酶（1×105U/g pro）来源于菠萝、无花果、木瓜等植物中，主要由内切酶、外切酶和风味蛋白酶组成，河南圣斯德实业有限公司；风味蛋白酶（2.2×104U/g pro）、胰蛋白酶（1.6×104U/g pro）、木瓜蛋白酶（3.7×104U/g pro）、中性蛋白酶（2.6×104U/g pro）河南圣斯德实业有限公司；其它试剂 国产分析纯试剂。

UDK 凯氏定氮仪 北京盈盛恒泰科技有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅 金坛市科杰仪器厂；S20pH 计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DDL-5M 离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解工艺流程 紫贻贝→采肉→高温蒸煮（115 ℃，20 min）→匀浆→酶解→灭酶（100 ℃，10 min）→离心（4000 r/min，20 min）→取上清液

操作要点：紫贻贝采肉，经高温蒸煮（115 ℃20 min），冷却后用组织捣碎机均浆，取90 g 按匀浆按1:3（V/V）的比例液加去离子水混匀，用0.1 mol/L盐酸或氢氧化钠调节pH 到预定值，加入一定量蛋白酶，在适宜的温度下酶解一定时间。灭酶（沸水浴10 min），取出冷却，离心（4000 r/min，20 min）取上清液备用。

1.2.2 酶解蛋白酶的筛选 按表1 酶解条件分别酶解0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5 和6 h，根据水解度和感官评分从供试的复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶筛选出酶解紫贻贝的蛋白制备鲜味肽的适宜蛋白酶。

表1 供试蛋白酶的酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions of protease

1.2.3 单因素实验 设定pH7、料液比1:3 g/mL、加酶量1000 U/g pro、温度50 ℃，酶解时间分别为1、2、3、4、5 h；设定酶解时间3 h、料液比1:3 g/mL、加酶量1000 U/g pro、温度50 ℃，pH 分别为4、5、6、7、8；设定酶解时间3 h、pH6、加酶量1000 U/g pro、温度50 ℃、料液比分别为1:1、1:2、1:3、1:4 和1:5 g/mL；设定酶解时间3 h、pH6、料液比1:2 g/mL、温度50 ℃，加酶量分别为500、1000、1500、2000、2500 U/g pro；设定酶解时间3 h、pH6、料液比1:2 g/mL、加酶量1000 U/g pro，温度分别为40、45、50、55、60 ℃；研究以上各因素对水解度及感官评分的影响来确定酶解的最佳工艺参数。

1.2.4 Plackett-Burman 试验 Plackett-Burnan 设计是一种有效的两水平试验设工艺技术设计方法[13]，从考察因素中快速筛选出最为重要的影响因素[14]，为进一步研究奠定良好基础。根据单因素试验结果，通过Plackett-Burman 试验对影响紫贻贝酶解工艺的5 个因素进行筛选，确定显著性影响因子，对五个因素分别选取1，-1 两水平，因素和水平见表2。

表2 Plackett-Burman 试验设计因素及水平Table 2 Plackett-Burman test design factors and levels

1.2.5 Box-Behnken 中心组合试验 在单因素及Plackett-Burman 试验的基础上，选择酶解时间（A）、pH（B）、加酶量（C）、温度（D）为因素，以水解度和感官评分为响应值，因素水平设计见表3。

1.2.6 水解度测定 采用甲醛滴定法[15-16]测定氨基酸态氮，按式（1）计算水解度。

其中总氮采用凯氏定氮法参照GB5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》的方法测定，按式（2）计算总氮量。

式（2）中：X-样品中氨基氮的含量（g/100 mL）；V1-测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液的体积（mL）；V2-试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准的体积（mL）；V3-样品稀释液取用量（mL）；C-氢氧化钠标准液的浓度（mol/L）；14-氮的摩尔质量（g/mol）；

1.2.7 膜过滤分级 参照范思华[17]的方法并做出适当修改。水解物用截留分子质量为10、3 kDa 的三级膜分离过滤系统分为3 个组分，分别命名为ZYB-1（3 kDa 透过液），ZYB-2（3 kDa 截留液），ZYB-3（10 kDa截留液）。

1.2.8 肽含量的测定 参照李学鹏[18]等的方法并做出适当修改。分别取2 mL 经三级膜分离系统的三个不同的组分液，加入等体积质量分数为10%三氯乙酸溶液，静置10 min，离心（4500 r/min、15 min、4 ℃），采用双缩脲法，在540 nm 波长处测定吸光度。以谷胱甘肽为标准，绘制标准曲线，根据标准曲线y=0.0388x+0.0176，R2=0.9983，计算肽含量。

1.2.9 感官评定方法 参考文献[19-20]采用综合评分法进行感官鉴评，并稍作修改。选取8 人（4 男4 女，年龄在20～30 岁之间）食品相关专业人员作为感官评定员，感官评定员在评定之前经过味道鉴评培训，在标准的感官鉴评室采用CSAS 感官评定系统进行感官评定，样品由系统随机编号。鉴评员从鲜味、甜味、苦味、咸味和酸味5 种味道进行打分评定，评分标准参照表4。

表4 味道标准参照表Table 4 Reference table of taste standards

评定步骤：评定员从低浓度至高浓度逐一品评某一滋味标准液并记录滋味强度，标准液在口中停留15～20 s 之后吐掉，蒸馏水漱口，取5 mL 酶解液放于口中，在口中停留15～20 s，之后吐掉，根据酶解液与各标准液滋味强度的相近性进行打分，然后采用加权法计算感官评分，权重系数表参考表5。

表5 感官评定综合评分权重系数表Table 5 Weight coefficient table of sensory evaluation comprehensive score

对各个指标做出评分后，再参考综合评分值计算公式得出酶解液综合风味值，具体为：

式（3）中，n 为对某试样进行感官品评的人数；Ai为第i 位评判人对试样的鲜味评分；Bj为第j 位评判人对试样甜味的打分；Ck为第k 位评判人对试样咸味的评分；Dt为第t 位评判人对试样酸味的打分；Er第r 位评判人对试样苦味的打分。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选结果

由图1A 所示，5 种蛋白酶的水解度均随着时间的延长而上升，在2 h 之前水解度速度上升较快，3 h后水解度上升缓慢，这可能是由于以下原因：蛋白酶活性随着酶解的进行而降低；一定浓度酶解产物的积累抑制了酶解的进行；中间产物已达到平衡。在上述因素的综合作用下，水解强度降低。由此得出：5 种蛋白酶的水解能力排序为：复合蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞风味蛋白酶＞胰蛋白酶，复合蛋白酶水解能力最强。由图1B 所示复合蛋白酶感官评分整体也比其他四种蛋白酶酶解物的感官评分要突出。因此，选择复合蛋白酶作为紫贻贝肉酶解的水解酶。

图1 蛋白酶的筛选Fig.1 Screening of protease

2.2 单因素实验结果

2.2.1 酶解时间对紫贻贝水解度及感官评分的影响

图2 所示，酶解初期，随着酶解时间的增加，水解度增长迅速，在酶解为3 h 趋于稳定，酶解产物酸、甜、苦、咸、鲜不同指标大部分都有所增加，感官综合评分先增后降。方差分析表明，在考察范围内（1～5 h），时间的变化对水解效果产生显著影响（P＜0.05）。经综合分析，酶解时间范围选择2～4 h 进行下一步试验。

图2 酶解时间对水解度和感官评价的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.2.2 pH 对紫贻贝水解度及感官评分的影响 图3所示，水解度和感官评分随着pH 的提高而增大，pH 为6 时，水解度最高，pH 为7 时，感官评分最高。随着pH 的进一步提高，水解度和感官评分呈现下降趋势。方差分析结果显示pH 在供试范围为（pH4～8）的变化对水解效果有显著影响（P＜0.05）。经综合分析，酶解pH 区间选择5～7 进行下一步试验。

图3 pH 对水解度和感官评价的影响Fig.3 Effect of pH on degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.2.3 料液比对紫贻贝水解度及感官评分的影响图4 所示，随着料液比的增大，水解度整体呈现下降趋势。方差分析表明，料液比在1:1～1:5 g/mL 范围内对水解效果产生显著影响（P＜0.05），在料液比1:2 g/mL 时，水解度最高，在料液比1:1 g/mL 时，感官评分最高。综合分析，料液比范围选择1:1～1:3 g/mL进行下一步试验。

图4 料液比对水解度和感官评价的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.2.4 加酶量对紫贻贝水解度及感官评价的影响 图5所示，随着酶用量的增加，水解度呈现上升趋势，感官评分呈现先上升后下降趋势。方差分析表明，在考察范围内（500～2500 U/g pro）加酶量的变化对水解效果产生显著影响（P＜0.05）。考虑到水解效果及成本，加酶量范围选择为500～1500 U/g pro 进行下一步试验。

图5 加酶量对水解度和感官评价的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.2.5 温度对紫贻贝水解度及感官评价的影响 图6所示，随着酶解温度的增加，水解度和感官评分先上升后下降。达到50 ℃左右时，水解度达到最大值，鲜味值最高，感官评分最高。方差分析表明，在考察范围内（40～60 ℃）温度的变化对水解效果产生显著影响（P＜0.05）。经综合分析，酶解温度区间选择为45～55 ℃进行下一步试验。

图6 温度对水解度和感官评价的影响Fig.6 Effect of temperature on degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.3 Plackett-Burman 试验

根据Minitab 16.0 导出的试验序号表，按照试验序号以及相关试验条件进行试验，结果见表6。

表6 Plackett-Burman 试验设计及结果Table 6 Plackett Burman test design and results

对得到的数据进一步分析，得到因素显著性图（见图7）、帕累托图（Pareto，见图8）。

如图7 所示，方形点表示显著性因素，圆形点表示不显著性因素。考察的5 个因素中有4 个对结果的影响是显著的。由图8 显示，对于结果影响强弱性为：pH＞加酶量＞温度＞时间。据此筛选出pH、加酶量、温度、时间4 个对结果影响较大的因素进行优化。

图7 水解度和感官评分因素显著性图Fig.7 Significance map of hydrolysis degree and sensory score factors

图8 水解度和感官评分帕累托图Fig.8 Pareto Diagram of degree of hydrolysis and sensory score

2.4 响应面试验结果

2.4.1 响应面优化试验设计结果 在筛选单因素的基础上，响应面优化试验以感官评分为主要指标，水解度为次要指标进行试验，试验方案及结果见表7。

表7 响应面设计方案与结果Table 7 Design scheme and results of response surface

经软件分析，得到水解度与各因素变量的多元二次回归方程模型为：

Y=45.08+0.15A+2.49B+1.53C+1.22D-2.42AB+0.70AC+1.13AD-2.54BC+3.96BD-4.65A2-4.45B2-3.66C2-2.89D2，Y 的回归模型系数R2为0.9471，说明水解度的实际值与预测值拟合较好。从表8 水解度方差分析表中可知，该模型P值小于0.001，具有极显著性。失拟项P值0.0939＞0.05，表明失拟项不显著，模型拟合程度好，本试验能够较好地揭露各因素对水解度结果的之间的关系。由回归模型进行显著性检验可知，一次项中B（pH）和C（加酶量）对水解度有极显著的影响（P＜0.01），D（温度）有显著影响（P＜0.05），A（酶解时间）无显著影响；交互项AB、BC 和BD 影响极显著（P＜0.01），其他均不显著。根据F值大小可知，影响紫贻贝酶解效果因素主次顺序为pH＞加酶量＞温度＞酶解时间。

表8 水解度回归与方差分析结果Table 8 Regression and analysis of variance results of hydrolysis degree

经软件分析，得到感官评价与各因素变量的多元二次回归方程模型为Y1=5.59+0.04A+0.37B+0.2C+0.25D-0.29AB+0.1AC+0.1AD-0.23BC+0.25BD+0.08CD-0.43A2-0.53B2-0.27C2-0.36D2，Y1的回归模型系数R2为0.8726，说明感官评价的实际值与预测值拟合较好。从表9 水解度方差分析表中可知，该模型P值小于0.001，具有极显著性。失拟项P值0.1606＞0.05，表明失拟项不显著，模型拟合程度好，本试验能够较好地说明各因素对感官评价结果的之间的关系。由回归模型进行显著性检验可知，一次项中B（pH）对感官评价有极显著的影响（P＜0.01），C（加酶量）和D（温度）有显著影响（P＜0.05），A（酶解时间）无显著影响；交互项BD 影响显著，其他均不显著。由F值大小可知，影响紫贻贝酶解感官评价因素主次顺序为pH＞温度＞加酶量＞酶解时间。

表9 感官评价回归与方差分析结果Table 9 Results of sensory evaluation regression and ANOVA

2.4.2 响应面分析 图9～图10 是根据回归方程绘制出的各因素交互作用的响应面，反映了各因素在制备的过程中对响应值的影响，其投影为等高线图。该组图直观反映了时间、pH、加酶量、温度分别对水解度和感官评价的影响，而等高线的形状则表示了两因素之间的影响强弱，圆表示两因素交互作用弱，椭圆则较强[21]。由图9 可知交互项AB、BC 和BD 响应曲面陡峭，等高线呈密集椭圆形[22]，说明两因素之间交互作用较强，影响显著。由图10 可知交互项BD 交互作用较强，影响显著。

图9 各因素交互作用对水解度影响的响应面图Fig.9 Response surface diagram of the effect of interaction of various factors on hydrolysis degree

图10 各因素交互作用对感官评价影响的响应面图Fig.10 Response surface graph of the effect of interaction of various factors on sensory evaluation

2.4.3 最佳工艺与验证 经软件分析确定紫贻贝酶解的最佳工艺为：酶解时间为3.57 h、pH 为6.34、加酶量为1120 U/g pro、酶解温度为53.64 ℃，料液比为1:2 g/mL，在此条件下水解度为44.37%，感官评分为5.65。

结合实际生产需要，最佳工艺调整为时间3.6 h、pH6.3、加酶量1120 U/g pro，温度54 ℃，料液比为1:2 g/mL，在此条件下做三次平行验证试验，测得水解度为44.52%±0.66%，感官评分为5.62±0.12，采用SPSS 进行T检验表明实际值与预测值无显著性差异（P水=0.253，P感=0.702），模型可靠。

2.5 超滤后各组分的肽含量和感官评价

组分ZYB-1、ZYB-2 和组分ZYB-3 的肽含量分别为2.74、8.77、9.54 mg/mL，由图11 可知ZYB-1的鲜味最强，高于组分ZYB-2 和组分ZYB-3，酸味和苦味轻微，甜味突出，ZYB-1、ZYB-2 和ZYB-3 的感官评分分别为6.11、4.85 和3.41，ZYB-1 的综合风味明显优于其他两个组分。刘源等[23]、赵阳等[24]、Smith 等[25]的研究结果表明，鲜味肽分子质量约为0.15～3 kDa，本文的研究结果也证实了相对分子量小于3 kDa 透过液中富集了大量的鲜味肽。

图11 超滤所得组分的感官评价雷达图Fig.11 Radar chart of sensory evaluation of components obtained by ultrafiltration

3 结论

紫贻贝经复合蛋白酶水解后可产生具有鲜味的肽类，证明采用酶水解技术制备鲜味肽的技术路线是可行的。鲜味肽主要集中在相对分子质量小于3 kDa的组分中，通过膜过滤技术能够有效提高鲜味肽的含量。采用响应面法优化水解工艺，得到最佳工艺参数为：酶解时间3.6 h、pH6.3、加酶量1120 U/g pro，酶解温度54 ℃，料液比为1:2 g/mL，在此条件下水解度达44.52%±0.66%，感官综合评分为5.62±0.12。采用高压蒸煮处理能够显著提高蛋白质的水解度，对提高蛋白质的回收率具有重要的意义。采用响应面分析法构建的水解模型具有很高的可靠性，对于实际生产具有一定的指导意义。目前，分子质量3 kDa透过液制备鲜味肽的研究比较多，而想要充分综合利用水产资源制备水产调味料，超滤分离出的其他组分也需进一步的产品开发，仍待学者更加深入的研究。