甘蔗新基因ShUGT2的生物信息学分析及亚细胞定位

李延博 王俊刚 赵婷婷 张树珍 熊国如

(1 海南大学园艺学院 海南海口 570228;2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所∕中国热带农业科学院甘蔗研究中心∕海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室 海南海口 571101)

糖基转移酶 （glycosyltransferases，GT）普遍存在于自然界生物体内，是一个庞大的基因家族，其作用是对糖基进行催化，将活性供体分子转移到激素、次级代谢物、蛋白等大小分子上［1］，改变受体分子的生物活性、稳定性、水溶性、运输特性、亚细胞定位及其与受体的相互识别等特性［2］。在植物体内最主要的糖基供体是尿核苷二磷酸糖基转移酶（UDP－glycosyltransferases，UGT），又称作UDP-糖基转移酶，它对于维持植物的生长发育有着重要作用［1］。

近年来，国内外对于UDP-糖基转移酶的研究较多，有很多UGT 基因在不同植物中被克隆出来，如拟南芥［3］、水稻［4］、小麦［5］、大豆［6］、烟草［7］等；对于它们的生物学功能也有进一步的研究，主要涉及植物的次级代谢、激素调节以及生长发育等几个方面［8-10］。如UGT76C2跟细胞分裂素有关，在该基因的过表达植株中，细胞分裂素N-糖苷含量明显上升，在沉默植株中则下降，证明UGT76C2通过糖基化影响了细胞生长和发育［11］。UGT73C5的过表达植株，其体内油菜素内酯减少且油菜素内酯糖苷增加，而抑制表达的株系结果正好相反，证明了UGT73C5通过调控植物体内油菜素内酯含量来调控植物生长发育［12］。而UGT74E2过表达则会导致植物体内生长素积累，从而导致植物生长缓慢，且出现矮小化等现象［13］。UGT78D1可以糖基化槲皮素和山奈酚的3-OH 位置，进而参与黄酮醇糖苷的生物合成［14］。

甘蔗（Saccharum officinarum）作为重要的热带经济作物，同时也是最大的糖料作物，对中国乃至世界的食糖产业贡献巨大［15］。甘蔗体内有着众多的糖基转移酶基因，但其在植物生长发育中的作用尚不清楚。为明确糖基转移酶基因在甘蔗内的功能，本研究利用甘蔗转录组数据克隆出一个UDP-糖基转移酶基因ShUGT2，对其生物信息学进行分析，通过构建亚细胞定位载体进行蛋白定位分析，运用半定量RT-PCR 技术确定该基因在甘蔗不同组织中的表达情况，为后续研究提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

甘蔗来源于中国热带农业科学院甘蔗研究中心儋州综合试验站甘蔗基地，水稻品种日本晴由武汉伯远生物公司提供。

1.1.2 试剂

感受态细胞DH 5α 购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、凝胶纯化回收试剂盒购于生工生物工程有限公司；半定量RT-PCR试剂、Taq 酶、测序载体、cDNA 合成试剂盒购于TaKaRa公司，RNA 提取试剂盒购于Omega 公司；pCAMBIA1300-GFP载体由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗ShUGT2基因的克隆

取生长成熟期甘蔗品种ROC22叶片，按试剂盒说明书提取RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测可知，28S、18S 和5S 条带清晰，无DNA 污染；紫外分光光度计测定RNA 浓度可知，RNA 样品满足后续试验需要。cDNA 第一链合成按TaKaRa 公司说明书进行操作。根据甘蔗转录组数据设计全长序列引物ShUGT2-F 和ShUGT2-R（表1），以cDNA 为模板进行PCR 扩增，反应体系如下：cDNA 模板 1 μL，2 ×Taq 酶 12.5 μL， 引 物 ShUGT2-F 1 μL， 引 物ShUGT2-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。扩增程序为：95℃ 7 min；95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃2 min，30 个循环；72℃10 min。采用琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，将目的片段切胶回收，连接到pMD19-T 载体，于 16℃培养 12 h；转入 DH 5α 感受态细胞，PCR 验证显示，菌液呈阳性克隆；将阳性单菌落送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。

表1 本实验所用引物序列

1.2.2 生物信息学分析方法

利用NCBI 数据库和DNAMAN 软件进行序列多重比对，使用MEGA6.0软件构建系统发育进化树。运用 ProtParam 软件 （https：//web.expasy.org/protparam/） 分析蛋白质理化性质， TMHMM Serverv.2.0 软 件 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测其跨膜区，InterProScan软件 （www. ebi. ac. uk/interPro/search/sequence-search）分析其结构域，使用SOPMA 软件（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html） 进行蛋白二级结构分析， 用Swiss-Model 软件（https：//swissmodel.expasy.org/） 进行蛋白三级结构建模。

1.2.3 ShUGT2蛋白的亚细胞定位

以pMD19-T 载体为模板，以ShUGT2-L-F 和ShUGT2-L-R为同源引物，进行PCR扩增，切胶回收目的片段；用限制性内切酶KpnⅠ单酶切pCAMBIA1300-GFP 载体，使其线性化；用DNA 回收试剂盒纯化酶切产物；将目的片段和线性克隆载体连接，于37℃金属浴30 min；随后立即冰水浴5 min，转入DH5α 感受态细胞，PCR 验证菌液呈阳性克隆，使用试剂盒提取质粒。

挑取成熟期的水稻品种日本晴叶片，切割至0.2 mm 左右，置于10 mL 酶解液（1.25%Cellulose R10 和0.75 % Macerozyme R10）中酶解，黑暗真空30 min，50 r/min 酶解4 h；加入等体积W5 溶液，经120 目细胞筛过滤，以200 r/min 离心3 min，弃上清；加入1 mL W5 溶液洗涤原生质体，之后以200 r/min 离心3 min；弃上清，加入1 mL MMG 溶液重悬，暗保存。

吸10 μL （2 μg/μL） 质粒DNA 于2 mL 离心管，缓慢加入100 μL 原生质体悬浮液，并混匀；加入110 μL 40%PEG 溶液，缓慢混匀，黑暗条件下转染15 min；加入400 μL W5 溶液，终止转染，以120 r/min 离心2 min；去上清，加入1 mL WI 溶液，暗培养12 h。空白对照载体pCAMBIA1300-GFP 操作同上。使用激光共聚焦显微镜观察定位结果。

1.2.4ShUGT2半定量RT-PCR表达分析

取成熟期甘蔗ROC22 的根、茎、叶组织，按Omega 公司试剂盒说明书提取RNA，反转录合成cDNA；根据目的基因的cDNA序列设引物ShUGT2-YF 和 ShUGT2-Y-R （表 1），以GAPDH为内参基因［16］，引物测序合成由上海生工生物工程技术有限公司完成。以cDNA 为模板，进行PCR 扩增，扩增程序为：95℃ 5 min ；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 20 s，28个循环；72℃10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用全自动数码凝胶图像分析系统观察结果并拍照。

2 结果与分析

2.1 甘蔗基因ShUGT2的克隆及序列分析

图1 甘蔗基因ShUGT2的PCR扩增产物

参考甘蔗转录组数据，利用Primer Premier 5.0 设计扩增引物ShUGT2-F 和ShUGT2-R，扩增出约1.8 kb 的目的基因片段（图1）。将PCR 凝胶产物回收，连接pMD19-T 载体并转化，测序后获得1 867 bp长度的序列。序列分析表明，ShUGT2含有1 782 bp 的完整开放阅读框，编码593 个氨基酸，根据氨基酸多重序列（图2）对比和系统进化树（图3）构建发现，该氨基酸序列与高粱的SbUGT2、玉米的ZmUGT2、谷子的SitUGT2、狗尾草的SvUGT2等具有较高的序列相似性，其中与高粱的SbUGT2（XP_002468380.1） 同源性最为接近，达到了92.45%。

图2 不同植物UGT氨基酸多重序列比对分析

续图2 不同植物UGT氨基酸多重序列比对分析

图3 系统进化树构建

2.2 生物信息学分析

通过理化性质分析可知，ShUGT2 编码蛋白理论等电点（pI）为8.16，相对分子量为67.28 kDa，不稳定系数为48.68，是一种不稳定蛋白，疏水性指数为-0.338，预测其为亲水性蛋白。富含精氨酸Arg（R）（10.5%）、丙氨酸Ala（A） （9.8%）、缬 氨 酸 Val （V）（8.8%）、 亮 氨 酸 Leu （L）（8.4%）、冬氨酸Asp（D）（7.3%）、甘氨酸Gly（G）（7.1%）等。

通过跨膜区预测发现，该蛋白具有1 个跨膜区，位于20～42 氨基酸的位置（图4）。氨基酸序列的保守结构域分析显示，ShUGT2 编码的氨基酸具有UDP-糖基转移酶家族的特征结构域，位于309～514个氨基酸（图5）。二级结构分析显示，该氨基酸存在α-螺旋、伸展链、β-转角和无规卷曲。其中，有265 个氨基酸形成α-螺旋，占44.69%，84 个氨基酸形成伸展链，占14.17%；30 个氨基酸形成β-转角，占5.06%；214 个氨基酸形成无规则卷曲，占36.09%（图6）。进一步通过同源建模得到该氨基酸产物的三级结构图（图7）。

2.3 ShUGT2蛋白的亚细胞定位

通过同源重组技术，将经菌液PCR验证（图8）呈阳性克隆的菌液提取pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP质粒，使用激光共聚焦显微镜观察转染后的原生质体的绿色荧光蛋白GFP表达情况。结果显示，对照pCAMBIA1300-GFP 空载体在原生质体的每个部位都有表达（图9-a），在线粒体上pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP 融合载体发出绿色荧光，具有明显的定位特征（图9-b），因此推论ShUGT2 编码蛋白是一种线粒体蛋白。

图4 跨膜区预测

图5 结构域分析

图6 二级结构预测

图7 三级结构建模

2.4 ShUGT2的半定量RT-PCR表达分析

选取甘蔗品种ROC22号叶片、茎和根部等组织器官，通过半定量RT-PCR 技术分析甘蔗ShUGT2基因的表达特性（图10）。ShUGT2在甘蔗的叶片、茎和根部均有表达，但表达的特异性并不明显。

图8 菌液PCR鉴定阳性克隆电泳结果

3 讨论

图9 ShUGT2蛋白的亚细胞定位

图10 半定量RT-PCR结果

UDP-糖基转移酶在维持细胞的生长发育方面发挥了重要作用。植物在大自然中生存需要快速地适应不断变化的内部和外部环境，其显著反应即产生大量的次级代谢产物，而这些代谢物的产生往往需要大量的糖基化修饰，为了鉴定ShUGT2蛋白功能，本研究成功地从甘蔗中克隆出了编码UDP-糖基转移酶基因ShUGT2。该基因开放阅读框长度为1 782 bp，编码593 个氨基酸，在ShUGT2 蛋白序列中，包含了UDP-糖基转移酶超家族的功能保守域IPR002495，属于GT8 家族的木聚糖α-葡萄糖醛酸转移酶。而GT8家族主要涉及木聚糖的生物合成，植物失去木聚糖基本上等于丧失了次生生长能力，会出现矮小化和不抽薹的现象，而适当提高木聚糖的合成可促进二次细胞壁的形成，使植物具有更强的支撑力和生长发育能力［17-18］。例如拟南芥中的糖基转移酶基因GUX1（AtPGSIP1）和GUX2（AtPGSIP3）可催化葡萄糖醛酸连接到木聚糖主链，从而形成植物的侧链，并几乎参与植物木聚糖所有侧链的合成［19］。

在对基因功能的研究发现，亚细胞定位与基因功能有着紧密联系；蛋白质位于不同的细胞部位中，所行使的功能也不同。本研究利用融合绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及原生质体瞬时表达技术对ShUGT2 编码蛋白进行亚细胞定位。结果表明，该蛋白定位于线粒体中，主要在线粒体内行使其功能。而线粒体在细胞分化、细胞凋亡、调节细胞离子稳态以及调控细胞增殖与代谢等多种过程中都发挥了重要作用［20］。因此，ShUGT2 蛋白很可能参与线粒体的代谢过程，通过参与木聚糖的合成，来调控细胞内半纤维素成分，促进二次细胞壁形成，从而促进细胞发育，为植物的正常生长发育发挥了重要作用。

虽然已从很多不同的植物材料中分离出UDP-糖基转移酶基因，但由于技术手段的局限性，一些基因的作用底物未被鉴定，作用机制尚未清楚，目前的研究方向多集中于植物的生长发育、代谢调节及激素平衡等方面。从半定量RT-PCR 中可看出，ShUGT2在甘蔗的根、茎、叶组织中均有表达。因此下一步的实验重点，将对甘蔗不同组织器官（根、茎、叶等）、不同生长发育阶段和不同影响因素下ShUGT2的表达特异性进行分析，对其展开更深入的研究。本研究为进一步分析该基因在甘蔗中的具体功能提供了依据。