改良芝加哥天蓝染色法在甲真菌检测中的应用

张绍武 冯长海

(1. 中国医科大学附属第四医院检验科, 沈阳 110032; 2. 上海皓信生物科技有限公司， 上海 201109)

甲真菌病是皮肤科常见的疾病之一，多数甲真病患者病情顽固，易交叉感染和复发，需要长期治疗，因此明确诊断尤其重要。直接镜检法及培养法为临床常用的真菌检查方法，培养法费时费力。镜检法主要有KOH湿片镜检和荧光镜检，KOH湿片镜检法因操作简单快捷、成本低廉，为实验室普遍采用，但该法阳性率不高[1-2]。荧光染色法检出率较高但需要荧光显微镜[3-4]。芝加哥天蓝染色法检测文献报道不多[5]，本试验通过改良芝加哥天蓝染色法(即芝加哥天蓝甘油染色法)和芝加哥天蓝染色法对疑似真菌感染的甲标本检测进行评估。

1 材料与方法

1.1 试剂

10% KOH(自制)，芝加哥天蓝染色液(芝加哥天蓝1 g，蒸馏水100 mL)，改良芝加哥天蓝染色液(芝加哥天蓝1 g，甘油20 mL，蒸馏水80 mL)。

1.2 仪器

OLYMPUS显微镜(日本，普通光源型号CX41FR)，Olympus EP50显微成像系统(德国)。

1.3 标本

200例皮肤科门诊疑似甲真菌病患者提供的患处甲屑。

1.4 方法

将疑似甲真菌病患者病甲屑用75%酒精消毒清洗后取适量甲屑置于一个0.6 mL的无菌离心管中，加10% KOH溶液致甲屑完全浸没，静置10 min备用。芝加哥天蓝染色法和芝加哥天蓝甘油染色法的操作为：上述10% KOH溶液处理过的甲屑溶解液振荡摇匀后各取理过的甲屑溶解液5 μL依次置于2块载玻片中央，上面分别加入5 μL芝加哥天蓝染色液或芝加哥天蓝甘油染色液，用加样枪头搅拌均匀后盖上盖玻片后镜检；镜检时间分别为盖上盖玻片后1 min、4 h、8 h、24 h、1周。

1.5 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件进行分析，计数资料以百分率(%)表示,两组之间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种方法显微镜下比较

芝加哥天蓝染色法可见菌丝颜色呈淡灰蓝色，背景细胞呈较淡灰紫色(见图1)，改良芝加哥天蓝染色法可见菌丝呈较深蓝色，背景细胞淡灰紫色，但杂质较芝加哥天蓝染色法少(见图2)。两种检测方法静置1 min和4 h时镜检均可检测出真菌菌丝。静置8 h观察时芝加哥天蓝染色法读片结果因干扰物较多效果较差或因水分丢失无法读片，但改良芝加哥天蓝染色法仍可读取静置8 h、24 h和1周时的样本检测结果。

图1 芝加哥天蓝染色法静置1 min(×400) 图2 改良芝加哥天蓝染色法静置1 min(×400)

2.2 两种方法阳性率的比较

200例疑似患者中，改良芝加哥天蓝染色法镜检阳性145 例，检出率 72.5%，芝加哥天蓝法涂片镜检阳性122例，检出率 61.0%。改良芝加哥天蓝染色法与芝加哥天蓝染色法检出率结果比较，差异有统计学意义 (χ2=21.043，P<0.05)。

3 讨 论

甲真菌病是一个影响人类健康的公共问题，全球患病率高达5.5%,且发病率随着易感人群的年龄增长显著升高,甲真菌病在所有甲病中约占50%。甲真菌KOH湿片法的阳性率较低。真菌荧光染色法在荧光显微镜下可见到亮蓝色菌体结构，真菌形态比KOH湿片法更易识别[6-7],但真菌在寄生过程中可导致宿主细胞含有部分真菌细胞壁成分，干扰真菌的识别，同样，荧光的淬灭作用及染液水份丢失也不利于阳性标本的保存。

芝加哥天蓝是一种重氮染料，可将真菌菌体成分染成蓝色，背景细胞染成淡紫色，易于将真菌菌体和背景细胞区分开来。不同国外文献中使用的染液染出的蓝色菌体细胞和紫色背景细胞颜色深浅程度不同[8-10]，提示芝加哥天蓝染液的质量对菌体和背景细胞染色效果会存在较大差异。本研究显示，按文献配方配制的芝加哥天蓝染液处理甲真菌病患者标本会出现真菌菌体蓝色较淡、背景杂质较多现象，且放置时间久会影响标本读片结果。

甘油作为保湿剂，可减慢标本中染液干涸的速度，利于标本的保存；同时作为促染剂，可增强作用底物的着色能力，易于区分真菌菌体成分和背景细胞。本研究中将芝加哥天蓝染液加入甘油配制成的改良芝加哥天蓝染液处理甲真菌病患者标后，真菌菌体成分蓝色更加明亮，背景细胞淡紫色更加透明，二者的色彩对比更加明显，且背景干净、杂质较少，同时染色后标本的保存时间也较芝加哥天蓝法久，提示改良芝加哥天蓝染色法染色效果优于芝加哥天蓝染色法。

改良芝加哥天蓝染色法对甲真菌的诊断提供了一种不需特殊检验设备、稳定性更强、阳性率更高、结果更易读取的检查方法，适合临床推广应用。