竹节香附素A对耐奥沙利铂肠癌细胞株的作用及机制研究*

孟春芹,刘先勇

(南京医科大学附属江宁医院中西医结合科,南京 211100)

肿瘤细胞耐药包括原发性耐药和获得性耐药。多数细胞耐药为获得性耐药，是在临床抗肿瘤药物治疗过程中诱导而逐渐产生的。其发生机制十分复杂，故目前仍无有效逆转方法。目前，化疗已成为大肠癌综合治疗中常用并且有效的方法。然而，随着现代化疗药物种类的增加，使用频次的增多、时间的延长，导致许多肠癌细胞产生耐药，使临床中化疗效果大大降低，所以，寻找新的天然抗肿瘤药物迫在眉睫。本课题组的前期实验已经证实，竹节香附素A(RA)能够抑制人结肠癌细胞株HCT116、HT29的增殖[1-2]。本实验旨在探索RA能否逆转HCT116/L-OHP对奥沙利铂的耐药性，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

RPMI-1640细胞培养基(含双抗)及胎牛血清(FBS)购自美国Hycolon公司；RA购自中国药品生物制品检定所，批号：141113； 奥沙利铂购自美仑生物，批号：O0801AS；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma 公司，批号：M2128；Annexin-V/PI凋亡试剂盒购自美国BD公司，批号为556547；逆转录试剂盒TaKaRa DDR037A、Power SYBR Green购自日本TaKaRa公司；β-actin、caspsae-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、P-gp、IκB-α、p65一抗及二抗，购自美国CST公司。

1.2 细胞株及培养

人结肠癌耐药细胞株HCT116/L-OHP购自上海博谷生物公司；细胞培养于含10% FBS的RPMI1640及培养基中，并用低浓度奥沙利铂(12.5 μg/mL)维持，置于37 ℃，含95% 空气、5% CO2、完全饱和湿度的培养箱中培养，于实验前两周停用奥沙利铂。

1.3 MTT实验检测细胞存活率

(1)分别取对数生长期的HCT116、HCT116/L-OHP细胞株，以6 000、8 000/孔接种于96孔板中，每组设6个副孔，培养24 h。加入不同浓度的RA(1、2、4、8 μmol/L)和奥沙利铂(12.5、25、50、100、200、400 μg/mL)培养24 h，再加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL/孔。继续孵育4 h后弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，避光振荡5～10 min，酶标仪490 nm处测吸光度(OD)。抑制率=1-实验组OD/对照组OD×100%，重复检测3次，分别计算两组细胞的半数抑菌浓度(IC50)，计算耐药指数；并确定RA对HCT116/L-OHP的无毒剂量(IC10)。(2)按上述步骤将HCT116/L-OHP种植于96孔板，分为空白组、奥沙利铂组、奥沙利铂联合RA组(联合组)，培养24 h后空白组加入不含药物的培养基、奥沙利铂组加入不同浓度的奥沙利铂(25、50、100、200、400 μg/mL)，联合组于不同浓度的奥沙利铂组加入IC10的RA，实验步骤同上，分别计算细胞增殖抑制率。后续实验中仅选取联合IC50的奥沙利铂进行研究。

1.4 流式细胞术检测凋亡率

HCT116/L-OHP细胞种植于6孔板中培养24 h，空白组加入完全培养基，奥沙利铂组中仅加入奥沙利铂，联合组中加入IC10的RA及奥沙利铂。继续孵育24 h，收集各组细胞，PBS冲洗后重悬于500 μL Binding Buffer中，分别加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光振荡10 min后上机进行检测。

1.5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

各组细胞处理终止后，收集细胞，先后用 TRIzol、氯仿提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测量RNA的浓度，然后保存于-80 ℃冰箱备用。根据TaKaRa逆转录试剂盒进行操作上样，最后用ABI7900实时荧光定量PCR仪进行反应。采用 2-ΔΔCt 法进行结果分析，将各组相对表达水平(RQ，RQ=2-ΔΔCt)值进行比较。△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因(内参为β-actin),△△Ct=△Ct实验组-△Ct空白组。

1.6 蛋白质免疫印迹(WB)检测相关蛋白表达

各组细胞处理终止后，收集细胞总蛋白。采用Bradford法(BCA)测定各样本蛋白浓度。每组取20～30 μg上样，分别用12%、10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，用湿转法转膜。转膜完成后5%牛血清清蛋白(BSA)室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜10 min×3 次后，二抗室温孵育 1 h。TBST再次洗膜10 min×3 次后使用化学发光成像仪进行条带分析。β-actin作为上样量参照。

1.7 免疫荧光实验

取对数生长期的HCT116/L-OHP细胞，接种于置有无菌盖玻片的6孔板中，培养24 h，处理后收集各组爬片细胞进行固定、破膜、封闭、抗体孵育，最后滴加含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察目的蛋白。

表1 RT-PCR检测相关基因引物序列

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 奥沙利铂、RA对HCT116、HCT116/L-OHP细胞增殖的影响

(1)不同浓度奥沙利铂分别作用于HCT116、HCT116/L-OHP细胞24 h，其抑制率随着浓度增加而增加，呈现浓度依赖性(图1A)。奥沙利铂对HCT116细胞株的半数抑制浓度(IC50)为17.01 μg/mL，而对HCT116/L-OHP细胞株则为234.38 μg/mL，耐药指数为13.78。(2)不同浓度RA作用于HCT116/L-OHP细胞株后，其抑制率逐渐增加(图1B)，一般IC10浓度被认为对细胞没有抑制作用，所以选择1 μmol/L的RA作为后续实验浓度。当RA联合奥沙利铂后，IC50从原来的(234.12±6.13)μg/mL降低到(140.45±2.25)μg/mL，差异有统计学意义(图1C)。根据IC50浓度，后续仅选择200 μg/mL的奥沙利铂作为实验浓度。

A：奥沙利铂对HCT116、HCT116/L-OHP细胞增殖的影响；B：RA对HCT116/L-OHP细胞增殖的影响；C：RA联合奥沙利铂对CT116/L-OHP细胞增殖的影响。

2.2 RA联合奥沙利铂对HCT116/L-OHP细胞凋亡的影响

2.2.1流式细胞术结果

奥沙利铂组HCT116/L-OHP细胞早期凋亡率为0.8%，晚期凋亡率为19.7%，总凋亡率为20.5%；而联合组HCT116/L-OHP早期凋亡率21.1%，总凋亡率34.4%(图2A)，凋亡率较奥沙利铂组明显升高。

2.2.2RT-PCR结果

凋亡标志性基因caspase-3、PARP在联合组中表达较奥沙利铂组明显升高，差异均有统计学意义P<0.05(图2B)。

A：RA联合奥沙利铂对HCT116/L-OHP凋亡率的影响；B：RA联合奥沙利铂对HCT116/L-OHP凋亡基因表达的影响；C：RA联合奥沙利铂对HCT116/L-OHP凋亡蛋白表达的影响。

2.2.3WB结果

奥沙利铂组凋亡标志性蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达较联合组明显减少(图2C)。

2.3 RA对耐药蛋白及核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响

RT-PCR结果显示，编码P-gp蛋白的基因MDR-1在联合组中表达较奥沙利铂组减少；免疫荧光及WB实验也显示，联合组中P-gp蛋白表达较单用奥沙利铂组减少，二者相一致(图3A、B、D)。此外，WB发现空白组中IκB-α、p65表达最高，奥沙利铂组较空白组表达减少，而联合组中表达最低(图3C)。

A：RA联合奥沙利铂对MDR-1基因的影响；B:WB实验显示RA联合奥沙利铂对P-gp蛋白的影响；C：RA联合奥沙利铂对NF-κB信号通路蛋白的影响;D:免疫荧光实验显示RA联合奥沙利铂对P-gp蛋白的影响。

3 讨 论

RA是从竹节香附中提取的三萜皂苷，竹节香附又叫两头尖，为毛莨科银莲花属植物多被银莲花的干燥根茎，《医方歌括》最早记载了两头尖可治疗乳癌。多项研究发现，RA不仅能抑制多种肿瘤细胞的增殖，还能增加细胞的敏感性，逆转耐药。GUO等[3]研究发现，RA能通过调控细胞周期和凋亡增加胆管癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。WANG等[4]发现RA能够抑制STAT3磷酸化，增加骨肉瘤细胞对化疗的敏感性逆转其耐药，从而促进细胞凋亡。PENG等[5]的实验发现，RA可调控STAT3/NFIL3信号轴逆转绒毛膜癌细胞的耐药性，增加细胞凋亡。本实验研究也发现，RA联合奥沙利铂后能使细胞增殖能力明显下降，细胞凋亡率增加，说明RA可增加HCT116/L-OHP细胞株对奥沙利铂的敏感性，逆转其耐药。

关于肿瘤耐药的机制，其主要原因是细胞对抗肿瘤药物吸收减少或排出增加，使细胞内药物浓度降低，细胞死亡减少，从而出现耐药，这种能控制药物进出细胞的机制被称为“药物膜泵”，而调控“药物膜泵”最主要的分子为P-gp蛋白[6]。该蛋白是在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现的一种高分子质量细胞膜糖蛋白，研究发现，其表达水平与细胞膜的通透性、细胞内药物浓度及细胞耐药程度有关[7]。杜梦楠[8]研究发现，P-gp在大肠癌组织中的表达均与组织分化程度、Duke′s分期、淋巴结转移有关，且分化程度越低、分期越晚，P-gp表达越高。YAN等[9]也发现，P-gp在肠癌组织中的表达较正常大肠组织明显增加。LIU等[10]发现，竹红菌乙素能够通过靶向声动力疗法逆转SGC7901/ADR细胞株的耐药性下调P-gp的表达。本实验也发现，编码P-gp的MDR-1基因在空白组中表达最高，奥沙利铂干预后表达减少，而奥沙利铂联合RA干预后表达最少；并且P-gp蛋白在联合组中表达也最少，说明RA联合奥沙利铂逆转HCT116/L-OHP耐药可能是通过下调P-gp实现的。

关于耐药的信号通路，国内外研究已证实，NF-κB信号通路的激活是多药耐药产生的重要机制[11]。NF-κB转录因子家族由5个成员组成，即RelA(p65)、RelB、cRel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，它们通过形成不同的同二聚体或异二聚体调节靶基因的表达，在炎症、免疫调节、细胞分化和肿瘤形成等过程中发挥作用[12]。静息状态时，NF-κB与其抑制物IκB相结合存在于细胞质中。当外界因素(细菌或病毒感染、炎性细胞因子、TNF、LPS、紫外线照射、电离辐射等)刺激时导致IKKβ亚单位激活,从而使IκBs丝氨酸的S32、S36磷酸化，启动细胞内的泛素化-蛋白酶系统，使IκBs蛋白降解,这样,活化的NF-κB进入细胞核发挥转录因子作用[13]。研究发现，NF-κB具有抗凋亡能力，化疗药物诱导细胞凋亡时可激活NF-κB，诱导凋亡抑制基因的表达，导致肿瘤细胞形成化疗抵抗[14]。大量研究证实，通过不同方法抑制NF-κB信号通路可提高恶性肿瘤对化疗的敏感性。LIU等[15]发现，通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路减少P-gp和LRP的表达来逆转鼻咽癌的多药耐药。林嘉麟[16]研究发现，在乳腺癌细胞中ClC-3通过NF-κB信号通路调控P-gp的表达，从而介导肿瘤细胞发生耐药。向磊等[17]研究发现，姜黄素可抑制NF-κB信号通路，从而增强结肠癌HCT-116细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。王子元等[18]也发现，健脾解毒方可通过NF-κB/Nrf2/MRP2信号通路逆转大肠癌多药耐药。本研究也发现，NF-κB信号通路中的IκB-α、p65在联合组中的表达较奥沙利铂组减少，而空白组表达最高，说明RA联合奥沙利铂逆转耐药可能与抑制了NF-κB信号通路有关。

综上所述，RA联合奥沙利铂可增加HCT116/L-OHP对奥沙利铂的敏感性，促进其凋亡，其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路减少耐药蛋白P-gp的表达实现的。