微型DNA条形码在水产类物种掺假检测中的应用

黄曼虹，熊 雄，袁方颖，操 敏，陆利霞,2，熊晓辉,2

(1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.江苏省食品安全快速检测公共技术服务中心，江苏 南京 211800)

随着我国经济的发展和人民生活、文化水平的不断提高，以低脂肪、高蛋白为主要特征的水产品已经成为我国居民动物蛋白摄入的主要来源之一，水产品消费量不断增大[1]。在水产品消费量增长的同时，人们对水产品的质量安全也提出了更高的要求，其中一个重要的方面就是对水产食品原料的生物种属进行准确的标识和鉴定。

水产类物种繁多，各种过敏原和含有天然毒素的有毒物种会给特定消费群体的健康带来严重威胁[2-3]。不同物种的营养价值、口感和价格等方面也存在巨大差异[4-5]，由此而产生的商业欺诈问题已经受到人们的广泛关注[6]。然而，由于不少商贩缺乏专业的水产类物种分类知识以及市场缺乏对一些水产类物种命名的统一标准，我国水产品市场上物种错标现象不断被曝光，如“真假鳕鱼”事件[7]和“真假三文鱼”事件[4]。此外，水产品物种掺假的问题并非我国独有，在世界各国均被广泛报道(表1)。

为了防止水产品物种掺假，建立一种快速高效的水产品物种鉴定技术迫在眉睫。传统的形态学检验法主要依赖于鉴定者的经验，对于亲缘关系近的物种鉴别难度较大[8]，而且被加工成鱼片、鱼丸和罐头等产品后，水产类物种特有的形态学特征遭到破坏，无法对物种做出准确鉴定。

随着分子生物学的发展，基于DNA的PCR技术在水产类物种鉴定中得到运用，已经成为水产类物种掺假检测的主要技术(表1)，其中最常见的一种就是标准DNA条形码技术[5]。在食品加工中的高温、高压、反复冻融和酸碱变化等因素均会使DNA发生降解，与标准DNA条形码(FDB，650 bp)相比，微型DNA条形码(MDB，<350 bp)在深加工水产品物种检测中具有更大的优势[9]。本文中，笔者综述MDB的原理、操作及最新研究进展，分析MDB在水产类物种掺假检测中的应用及规则，并对MDB的关键问题进行初步探讨。

表1 世界各国水产品掺假现状

1 FDB检测水产类物种掺假

FDB是由加拿大科学家Hebert等[34]在2003年首次提出的，其基本原理是利用一段较短的DNA标准序列的多态性来实现快速、准确的物种鉴定。对动物而言，一般为线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ基因(COⅠ)5’端的一段长约650 bp的片段。目前，FDB技术在水产类物种掺假检测中得到了广泛应用(表1)。美国食品药品监督管理局将DNA条形码纳入鱼类监管百科全书(RFE)来进行市场上鱼类替代品的检测[35]，巴西联邦政府也将FDB作为全国范围内对加工水产品进行常规和系统管理的标准鉴定方法[31]。

然而，随着FDB研究的深入，研究者们发现其在实际应用中也存在一些问题。如Xiong等[27]利用FDB对市售干制鳕鱼样品进行物种鉴定时发现部分样品无法成功扩增出650 bp的FDB片段。除了干制品，Guardone等[36]发现鱼类罐装制品也无法扩增出FDB片段。此外，Günther等[37]在鱼糜、鱼籽酱以及烟熏水产制品中均发现FDB扩增失败的现象。最新报道表明，烤鳕鱼制品也无法成功扩增出FDB片段，其失败率可达24.2%[7]。

食品加工过程中的高温、高压、反复冻融和酸碱变化等因素导致的DNA降解被认为是FDB扩增失败的主要因素[38]。Gryson等[39]认为pH变化可导致DNA的降解。黄娅琳[40]研究发现高温对DNA的降解和后续PCR扩增有一定影响，特别是当加热温度大于140 ℃、加热时间超过80 min时，PCR扩增产物条带明显减弱。因此，筛选较短的标准DNA片段(即MDB)并探讨其对深加工食品进行物种鉴定的可行性引起了人们的广泛关注。如Günther等[37]设计新的通用引物以扩增更短的线粒体COⅠ基因片段(约326 bp)，结果发现，16份FDB扩增失败的样品均成功扩增出326 bp的目标基因片段，并且测序结果发现该片段可成功鉴定相应的物种。此外，Xiong等[7]利用一个更短的COⅠ基因片段(约192 bp)实现了对7份FDB技术扩增失败的市售烤鳕鱼样品的物种准确鉴定。由此可见，MDB概念的提出给深加工鱼肉制品中鱼肉物种鉴定提供了新思路。

2 MDB检测水产类物种掺假

2.1 MDB简介

MDB是由加拿大Guelph大学Hajibabaei等[9]首次提出，该团队采用序列分析的方法从理论上证实了被分割的短片段序列与原DNA序列具有同等的物种鉴别能力。同时，该团队从已经发生DNA降解的馆藏标本中成功扩增出134 bp的目的基因片段，验证了该片段在哥斯达黎加地区寄生蜂物种鉴定中的可行性。在此基础之上，其他学者对MDB的适宜长度进行了深入研究，并提出条形码长度大于100 bp就可以解决90%以上的物种鉴定问题，即100 bp序列长度就已包含可以进行分类鉴定所需的DNA信息。根据这一结果，该研究团队基于COⅠ基因设计出能扩增130 bp微型条形码片段的通用引物，并对该引物的扩增能力进行检验，得出该引物扩增MDB的成功率比通常所用的扩增FDB的成功率高。

MDB的应用主要包括以下几个流程(图1)：①样品的采集与处理；②DNA的提取和冷冻保藏；③设计引物对目的DNA进行PCR扩增，选择电泳条带清晰单一产物；④PCR产物的纯化与测序；⑤使用BioEdit软件进行序列修剪和比对；⑥将测序所得序列提交至NCBI或BOLD数据库，获取与目标序列相似度>98%[15]的物种，以此确定样品的物种。

图1 MDB技术应用流程Fig.1 Process of MDB application

就目前文献来看，国内外多个研究团队已经就鱼类MDB鉴定技术展开了相关研究(表1、2)。如Armani等[41]利用MDB对太湖银鱼、沙丁鱼和凤尾鱼等鱼类进行物种鉴定。陈文炳等[42]利用MDB对美洲鳗、欧洲鳗和日本鳗进行物种鉴定。此外，甲壳类动物也可利用MDB技术进行准确鉴定[43]。

尽管如此，关于FDB和MDB物种鉴定能力的比较仍在讨论当中。有部分学者认为FDB的物种鉴定能力优于MDB。如Guardone等[36]对意大利市场上277份水产品样品调研发现，FDB可对55.1%的样品进行鉴定，显著高于MDB(14.6%)。此外，Armani等[44]指出，降低片段长度会对条形码的物种鉴定能力有负面影响。然而，Armani等[10]对寿司中鱼类产品的研究发现，FDB和MDB的物种鉴定能力相同。Shokralla等[45]基于COⅠ基因，筛选出了6个MDB片段(127～314 bp)，并利用96份鱼类样品对这些MDB片段的可靠性进行验证，结果发现，93.2%的鱼类样品可以在种或属水平进行鉴定，MDB可对88.6%的样品进行鉴定，远高于FDB(20.5%)。Labrador等[46]对菲律宾的39份沙丁鱼样品进行抽查，结果发现FDB无法扩增出序列片段，而MDB则可对64%的样品进行鉴定。由此可见：与FDB相比，MDB具有较高的物种鉴定能力。

MDB弥补了FDB由于DNA降解而导致鉴定失败的缺点，有望成为替代FDB的水产类物种鉴定技术。然而，越来越多的研究证实，MDB的片段长度选择以及目的基因筛选是影响其物种鉴定能力的重要因素。因此，进行水产品鉴定时，MDB目标片段的适宜长度以及目的基因的选取仍需进一步研究。

2.2 MDB目标片段的长度选择

目标片段的长度对MDB的物种鉴定能力具有重要的影响。一般而言，随着目标片段长度的缩短，其物种鉴定能力逐渐减弱。Meusnier等[47]对现有DNA条形码数据库中的序列进行模拟计算，结果发现，当COⅠ基因片段长度大于100 bp时即可鉴定90%的物种，当COⅠ基因片段长度大于250 bp时即可鉴定95%的物种。Pollack等[48]对基于COⅠ基因的两对MDB片段进行比较时发现，长为226 bp的MDB片段(92%～94%)，其物种鉴定能力优于长为208 bp的MDB片段(67%～90%)。Sultana等[49]提出，当MDB的目标片段长度≤150 bp时，目标片段无法利用普通一代测序技术进行成功测序；为此，该团队设计了长约295 bp的鱼类通用MDB片段，并证实了该MDB片段可成功鉴定33种鱼类。

然而，在水产品品种鉴定中，不同科研团队并未就MDB片段长度达成一致[32,41-45,47,49-55](表2)。

表2 用于水产类物种掺假检测中的MDB片段

如Armani等[54]基于16S rRNA基因筛选了长为118 bp的MDB片段，并证明了该MDB片段可以准确鉴定鲱科和鲭科的鱼类品种。潘艳仪等[50]基于COⅠ基因筛选了长为136 bp的MDB片段，并利用克隆测序法获得高质量的测序结果，以此可对鱼、虾等11个肉类物种进行准确鉴定。程鹏等[56]对三段长度分别为100、150和200 bp的鱼类COⅠ序列进行物种鉴定能力的比较，结果发现，当序列长度为100 bp时，其物种鉴定能力明显减弱；基于此，该团队提出200 bp的MDB片段在鱼类样品鉴定中具有很高的准确性。Shokralla等[45]基于COⅠ基因，筛选出了长为127、129、208、226、227和314 bp的6个MDB片段，研究发现其中长为226 bp的片段可对88.6%的鱼类样品进行物种鉴定，远优于其他的MDB片段。Günther等[37]利用基于COⅠ基因长为313 bp的MDB片段可对鱼类、虾类进行物种鉴定。最新研究表明，基于16S rRNA长约313 bp的MDB片段也可对太湖银鱼、沙丁鱼等鱼类[41]以及十足目甲壳类[43]进行物种鉴定。

2.3 MDB目的基因的筛选

一般而言，线粒体基因组和核基因组均可以作为MDB的目的基因。线粒体基因组具有结构简单、序列和组成比较保守、母系遗传、无重组以及单拷贝等特点[57]。同时由于线粒体基因组的分子量比较小、进化速度快，所以在物种鉴定的研究中经常被选取为目的基因[58]。

目前，常用于水产类物种鉴定中的目的基因有COⅠ基因、16S rRNA基因和细胞色素b基因(Cytb)(图2)。Mitchell等[32]基于COⅠ基因开发了一种微型DNA条形码方法，可用于区分金枪鱼罐头中常见的物种。Spielmann等[43]分别选取16S rRNA和COⅠ基因为目的基因，对甲壳类动物进行物种鉴定，结果发现，基于16S rRNA的条形码测得序列质量较低，鉴定甲壳类动物最合适的目的基因是COⅠ基因。而Armani等[41]基于16S rRNA基因设计的FOR16spc和REV16spc引物对鳕鱼、银鱼等的物种鉴定能力较强。之后，该团队继续以16S rRNA为目的基因设计MDB，可对市售97%(207份)的鲱科等鱼类物种样品进行成功鉴定[54]。同时，Sevilla等[55]设计的基于Cytb基因的MDB，可对硬骨鱼纲200多种海洋鱼类进行物种鉴定。Fernandes等[51]基于Cytb基因设计的MDB可对99.3%的4种常见鳕鱼进行物种水平上的准确鉴定。

图2 微型DNA条形码在目的基因中的位置Fig.2 Location of the mini DNA barcoding in the target genes

除此之外，基于核基因组的MDB也可对水产类物种进行鉴定。Ma等[59]研究发现，以磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)为代表的核基因组，可成功应用于对虾总科的系统发育研究，为这些物种的分类提供了有力的工具。Tsang等[60]选取PEPCK基因为目的基因对甲壳类动物进行DNA扩增，验证了PEPCK基因对甲壳类动物DNA样品的高效性。

3 结论

目前，MDB弥补了FDB由于DNA降解而导致鉴定失败的缺点，有望成为替代FDB的水产类物种掺假检测技术。目标片段的长度和目的基因的筛选对MDB技术的物种鉴定能力具有重要的影响。随着目标片段长度的缩短，MDB的物种鉴定能力逐渐减弱。此外，线粒体基因组和核基因组均可以作为MDB的目的基因。

然而，随着对MDB研究的深入，研究者们逐渐发现了MDB的缺陷：第一，抑制剂或其他某些物质的存在可能会导致DNA无法进行扩增从而使样品鉴定失败，而正常的鱼糜加工物质并不是失败的原因；第二，数据库中的序列不全，或者序列错误导致了鉴定结果的错误。由于BOLD和GenBank数据库均为开放平台，所有研究者均可提交序列，且数据库自身并不会核对提交物种序列。MDB对于水产品的鉴定结果依赖于GenBank和BOLD数据库的准确性、规范性和完整性。因此，在利用FDB和MDB进行物种鉴定时，可通过多次下载序列来对数据库中的序列进行核查。