聚乳酸蛋白酶促降解及微生物降解综述

冯 娟 李冠锋 蒋全吉 祝思瑜

（台州科技职业学院，浙江 台州 318020）

0 引言

当今，石油的短缺和“白色污染”日益严重，人们对环境的保护意识逐渐增强。20 世纪以来，人们一直以来致力于生物可降解塑料的研究。其中，聚乳酸是以乳酸为原料，通过聚合反应得到的一种线型热塑性生物可降解的脂肪族聚酯[1]，在微生物环境中可以被完全水解为CO2和H2O，被认为是替代石化基聚合物最有前景的生物降解塑料。生物可降解塑料聚乳酸的合成可以上溯至1932年，Carothers 等采用丙交酯开环聚合法首次合成了PLA。1954年，杜邦公司进一步研发了高分子量PLA 聚合物，并获得专利。由于原料具有可循环再生性、反复热加工性、生物相容性、无毒性等优点， 被广泛地应用在生物医学、 包装材料、农业、防治等领域。最近几年对聚乳酸的性能改良研究很多，PLA 产品的性能显著提高， 生产成本不断地降低，其应用方面逐渐由高端的医疗领域，应用到电子领域、一次性用品等领域。聚乳酸是一种新型的高分子聚合物，不溶于水、乙醇，可溶于二氯甲烷(DCM)、丙酮等。

国内外有很多研究表明， 聚乳酸在自然条件下，微生物对聚乳酸的降解起到关键作用。在微生物环境中，由于环境因素如pH、温度、湿度、营养等因素的不同对微生物种群和不同微生物的活性具有不同的影响，不同环境的微生物对PLA 降解具有不同的作用。PLA 虽然在自然环境下可彻底降解，但在自然环境中降解速率比较缓慢，因此，如何利用微生物提高聚乳酸的降解速率和筛选有用的降解微生物成为当前研究的热点之一。本文主要对微生物降解聚乳酸的作用机理及降解微生物筛选的研究进展进行总结和概述，并在此基础对其生物降解的发展形势做出展望。

1 P LA 蛋白酶促降降解机理

有机分子经过生物氧化或其他的生物转化而变成更小的分子的过程叫作生物降解或生化降解，有机物的生物降解具有重大环境意义。由于微生物有着繁多的种类和较快的代谢速率，所以微生物在生物降解过程中扮演着重要的角色。聚乳酸的降解可以分为水解、光降解、微生物降解和酶催化降解。微生物在降解聚乳酸材料中起到非常重要的作用。PLA 被微生物降解过程可以概括为： 有些微生物可以分泌胞外解聚酶， 扩散进入聚乳酸无定形或者较少有序的区域，逐渐降解PLA 的结晶区域。解聚酶的降解，使PLA 分子酯健断裂，产生寡聚体、二聚体和单体。因为降解产物非常小，可以通过半透性细菌膜，被作为碳源和能源被吸收和利用，最终分解成二氧化碳和水[2]。

在自然降解环境下聚乳酸本身不容易被微生物、酶等直接降解，生物降解之前，一般需先水解[3]。 PLA吸水后，其大分子主链中的酯键先水解断裂。相对分子质量降低，分子骨架有所破裂，形成相对分子质量较低的组分。一般情况下，聚乳酸水解到一定程度，方可在酶的作用下继续新陈代谢，完成降解。微生物蛋白酶和脂肪酶具有降解PLA 能力。但研究表明，唯一能使聚乳酸酯不经水解而直接发生作用的只有蛋白酶K。1981年，利物浦大学威廉姆斯D、F.提出蛋白酶K 对聚乳酸的酶促降解作用。 之后更多的研究表明，蛋白酶K 对聚乳酸的降解起到关键作用。很多聚乳酸降解酶属于蛋白酶组。蛋白酶能降解聚乳酸是因为主要降解的聚乳酸的α-酯键。PLA 降解微生物产生的酶主要是蛋白酶（丝氨酸蛋白酶），少数是脂肪酶（酯酶）和角质酶。丝氨酸蛋白酶是聚乳酸降解蛋白酶（如蛋白酶K、a-糜蛋白酶、枯草杆菌素、胰蛋白酶和蛋白酶）的主要成员。蛋白酶K 降解PLA 的机理分为四个阶段：（1）底物结合；（2）亲核攻击；（3）质子化；（4）酯水解。 蛋白酶K 序列中的主要残基为Ser329、His174和Asp144。 起初丝氨酸残基被周边丝氨酸残基链激活， 激活的羰基通过亲核催化与酯键反应使酯键断裂，PLLA 中的碳被丝氨酸酯化，并且裂解PLLA+的O-末端成为自由状态， 水取代了裂解的PLLA+的O-末端，形成了具有正常羧基的乳酸产物和丝氨酸羟基[5]。

2 P LA 微生物降解

1997年，Pranamuda[6]首次报告关于PLA 降解菌的筛选，该菌命名为Amycolatopsis HT-32，在14 天的液体培养中， 可使得60%的聚乳酸薄膜发生降解。这也是关于PLA 降解菌株的首次报道。 国内外报道的PLA 降解菌主要有威威达湖伦茨氏菌、 甘蔗兰希氏菌、 芽孢杆菌、寡养单胞菌及真菌放线菌等，但普遍存在降解率低的问题， 菌株对pH 的耐受范围有限的缺陷。郑霞等[7]人研究表明PLA 在土壤中的自然降解效率较低，12 个月后，PLA 试件质量损失率仅达到0.23%，PLA 重均分子量降低了15.3%，PLA 试件的冲击强度和拉伸强度分别降低了17.4%和17.2%。林娟等[8]从垃圾填埋场取土样，以明胶为唯一碳源，筛选到一株为L.waywayandensis 具有降解聚乳酸能力的微生物，经条件优化，培养25 天后，聚乳酸失重可达84.8%。此外，该研究表明，蛋白酶在降解聚乳酸过程中，发挥了很大的作用。范森[9]等人通过对通过对沼泽地、芒果林地、稻田3 种不同土壤菌群结构的分析，得出PLA 材料生物降解率分别为13.7%、10.6%和4.5%。同行得出，Proteobacteria 和Bacteroidetes，是降解聚乳酸材料的优势菌群。贾昊等[10]人，从山东潍坊使用聚乳酸/聚己二酸-对苯二甲酸丁二酯共混物（PLA/PBAT）地膜土壤中，采用以聚乳酸（PLA）为唯一碳源的无机盐培养养基筛选PLA 降解菌。 从土壤中筛选获得了一株产蛋白酶的 PLA 降解菌Pseudomonas mendocina，经过条件优化，该PLA 降解菌产蛋白酶可催化降解PLA 的酯键，5d 内PLA 降解率可达29.35%。该菌被保藏中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），并申请发明专利进行保护。

P.Sriyapai，T 等[11]从泰国的垃圾填埋场收集了17 个土壤样本进行PLA 聚酯降解菌的筛选，Actinomadura sp.TF1、Streptomyces sp.APL3 在pH6.0 ～8.0 和 温 度40～60℃之间表现出最高的解聚酶活性。 菌株TF1 和APL3 组成解聚酶的氨基酸具有高度保守性五肽催化三联体（Gly-His-Ser-Met-Gly），已被证明是酯酶脂肪酶 的 一 部 分。Titiporn Panyachanakul 等[12]将Actinomadura keratinilytica strain T16-1 培养在5L 的发酵罐中，控制pH 为8.0，等条件，培养72 h，结果表明，产生的乳酸效价为16651 mg/L，降解率为89%。然而，PLA 降解过程中产生了乳酸作为降解聚乳酸的抑制剂， 该实验用透析方法降低发酵液中的乳酸浓度。 用透析袋进行的实验获得了PLA 降解率为99.93%，而未透析组的聚乳酸降解率约14.75%。用透析方法协同发酵的方法效率提高约6 倍。这也是第一篇关于聚乳酸在5 L 生物反应器中放大培养进行降解实验的报道。同时，该论文也表明，现在对于聚乳酸的微生物降解工艺研究的并不是很多，评估提高聚乳酸降解效率的潜在方法。

3 结语

聚乳酸作为传统不可降解材料的替代品，随着现代分子生物学技术的发展，如高通量测序等技术的发展，对聚乳酸降解的微生物群落研究更为广泛。影响聚乳酸降解的因素有很多，比如高效的筛选菌种方法的建立、聚乳酸降解微生物堆肥方法等、明胶、酪蛋白等物质的诱导作用、高效降解酶的提取及应用、工艺条件如温度与PH 等条件控制。聚乳酸研究发展趋势为: 微生物降解聚乳酸的机理将得到更广泛的研究；筛选降解聚乳酸微生物的方法越来越多与技术将越来越成熟；逐渐从传统方法筛选和育菌模式转为更为先进的分子技术； 将不断地完善其降解方法与条件，能在自然状态下，聚乳酸相关产量将被相关微生物及生物制品高效、快速、安全地降解[13]。

如何获得一株高效及应用性强的微生物或寻求到具有高效降解能力的酶，仍然是现在从事该研究的主要方向。

然而，有些实验室能够筛选到具有一定降解聚乳酸能力的微生物，但是对于聚乳酸降解的工艺流程与现实应用鲜为报告。目前，国内外尚无可行可靠的具有产业化生产价值的降解PLA 微生物或相关生物制剂的开发与投入。因此，该课题的研究具有一定的环保价值、经济效益和研究价值。