基于网络药理学探讨预知子抗抑郁的作用机制

钱慧琴，彭 媛，黄秀秀，于舒雁，刘冰冰，王 宁，赵永恒

（1.新乡医学院三全学院，河南新乡 453000；2.郑州黄河护理职业学院，河南郑州 450066；3.湖北医药学院，湖北十堰 442000）

抑郁症是一种仅次于心血管疾病的第二大慢性疾病[1]，同时也是全球最常见的致残原因之一。常见临床症状是以抑郁情绪、兴趣丧失、精力减少等为主，严重影响人的思想，情绪和身体健康[2]。目前，临床治疗抑郁症多以西药为主，尽管它可以起到较好的治疗作用，但易出现恶心、呕吐、口腔溃疡、焦躁不安等不良反应[3]。中药对抑郁症的治疗虽起效缓慢，但是却很少发生不良反应[4]，因此，从中药中寻找抗抑郁药已成为当代药学研究的一个热点。

预知子，又名八月札、八月瓜、野香蕉等，为木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三叶木通fAkebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.australis（Diels）Rehd.的果实。果实鲜甜可口，维生素C、氨基酸和蛋白含量较高，具有提高免疫力，延缓衰老等保健作用[5−7]，具有较高的食用价值。预知子作为中药使用，能疏肝理气，活血止痛，散结，利尿[8]。中医临床认为有疏肝理气的中药具有抗抑郁的作用[4]。中医临床实践发现预知子及其复方消郁颗粒治疗抑郁症疗效较好[9]，且经实验研究证实，其提取物可通过调控神经可塑性相关蛋白的水平而具有抗抑郁作用[10]。然而其抗抑郁的活性成分及作用机制尚不明确。

网络药理学是将多向药理学和系统生物学整合的一种新的药物研究方法，从“多成分，多靶点，多通路”的角度全面系统地探讨中药治疗疾病的作用机制。因此，本研究利用网络药理学揭示预知子抗抑郁的物质作用基础和作用机制，为抑郁症药物的研发提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），Pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），Swiss TargetPrediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/），GeneCards 数据库（ https://www.genecards.org/），STRING 平台（https://string-db.org/），DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），Cytoscape 3.6.0 软件。

1.2 实验方法

1.2.1 预知子活性成分收集与筛选 使用TCMSP数据库挖掘预知子的化学成分，筛选并保存类药性（DL）≥0.10，口服生物利用度（OB）≥20%的活性成分[11]，同时将未符合筛选标准，但生物活性较好的成分纳入预知子活性成分。使用PubChem 数据库获取筛选活性成分的结构的SDF 和SMILES 格式。

1.2.2 预知子抗抑郁靶点收集 将以上获取的预知子有效成分分子结构（sdf）和Smiles 格式分别导入基于药效团模型的药物靶点的PharmMapper 和利用化学相似性预测靶点的Swiss TargetPrediction 数据库中，预测预知子化合物作用靶点。为了获取可靠性较高的靶点，只保留PharmMapper 中Norm fit score≥0.9[12]和Swiss TargetPrediction 中Probability≥0.5[13]的药物靶点。

以“Depression”为关键词从 GeneCards 数据库收集抑郁相关靶点。采用Omicshare 平台上的维恩图工具找出抑郁相关靶点与活性成分对应靶点的共同靶蛋白，即为预知子抗抑郁的作用靶点。

1.2.3 网络构建 将预知子抗抑郁相关靶点导入String 数据库中，物种设置为“homo spaiens”，最低相互作用阈值设为0.7，其余参数保持默认值[14]。获取预知子抗抑郁靶蛋白的互作关系（Protein-protein interactions,PPI）。

使用Cytoscape 3.6.0 软件构建化合物-靶点和PPI 网络，网络拓扑参数度（degree）值、介数（Betweenness Centrality）和接近中心性（Closeness Centrality）可用于评价节点在网络中重要性。度值是指一个节点与多少个节点直接相连，与其他点连接的个数越多，介数是计算通过某个节点的最短路径数，而接近中心性是指一个节点到其他节点的所有最短路径之和的倒数。节点的度值、介数和接近中心性越大，说明该节点在网络中越处于核心位置。一般节点度值，介数和接近中心性大于其平均值，则可被认为该节点为网络中的核心节点[15]。

1.2.4 信号通路与生物过程分析 将上述预知子抗抑郁关键作用靶点的uniprit ID 导入DAVID 6.8 数据库中，进行京都基因与基因组百科全书（ KEGG）代谢通路和基因本位（ GO） 富集分析。

1.2.5 预知子核心活性成分-靶点分子对接 从Pubchem 数据库中下载预知子核心活性成分的3D 结构，PDB 数据库中下载核心靶蛋白的3D 结构。采用AutoDock vina 软件实施活性成分-靶点分子对接。采用Pymol 软件将分值最低且具较好构象的分子对接结果可视化。

2 结果与分析

2.1 预知子化合物-靶点网络

由TCMSP 数据库检索并筛选得到23 个活性成分，由于Calceolarioside B[16]和 akebonoic acid[17]的OB 值较低，Ferulic acid[18]的DL 值较低，但是它们都具有较好的生物活性，故考虑将其纳入分析，最终得到预知子活性成分26 个（见表1）。针对每个活性成分，通过PharmMapper 和Swiss TargetPrediction数据库检索并筛选，共得到118 个化学成分靶点。利用GeneCards 数据库挖掘到抑郁相关的靶点有8959 个。将118 个预知子有效成分靶点与8959 个抑郁相关靶点进行匹配，共得到95 个预知子抗抑郁靶点（见图1）。

表1 预知子活性化合物基本信息Table 1 Detailed information of active compounds of Akebiae Fructus

图1 成分靶点与疾病靶点交集的维恩图Fig.1 Venn diagram after intersection of component targets and disease targets

预知子化合物-靶点网络如图2所示，图2中圆形代表预知子化合物，三角形代表预知子抗抑郁靶点，共有121 个节点，500 条边。由网络拓扑分析可知，化合物的平均连接度值、介数和接近中心性分别为19.23、0.05 和0.41，说明预知子化合物作用于多个靶点。经由网络拓扑参数筛选，共有6 个重要活性成分，包括木通苯乙醇B （C1,degree=39）、硬脂酸甘油酯（C25,degree=31）、豆甾醇葡萄糖苷（C11,Degree=29）、齐墩果酸（C2,Degree=28）、西托糖苷（C3,Degree=25）、蝙蝠葛碱（C14,Degree=23），推测以上活性成分为预知子抗抑郁的核心有效成分。

2.2 PPI 网络

将String 数据库中获取的个蛋白互作关系导入Cytoscape3.6.0 软件中构建PPI 网络（图3），图3中共有76 个节点和174 条边，经过网络拓扑分析可知，8 个靶点的度值、介数和接近中心性大于其平均值（4.58、0.03 和0.42），包括表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶1/8（MAPK1/8）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、热休克蛋白HSP 90α（HSP90AA1）、雄激素受体（AR）、雌激素受体（ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP3），提示以上靶点是预知子治疗抑郁症的核心靶点。

图3 PPI 网络Fig.3 PPI Network

2.3 通路富集分析

为了探究预知子抑郁症相关靶点的GO 生物功能，通过DAVID 数据库对8 个预知子抗抑郁关键靶点进行基因的功能注释及通路富集分析。以显著性P<0.05 为筛选条件，共筛选出9 个生物过程（Biological Process），主要涉及应激反应（response to stress）、ERBB2 信号通路（ERBB2 signaling pathway）、一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）等。4 个细胞组成（Cell Component），包括细胞核（nucleus）、细胞质（cytoplasm）、细胞溶质（cytosol）等。9 个分子功能（Molecular Function），主要涉及一氧化氮合酶调节活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、酶结合（enzyme binding）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等。预知子抗抑郁核心靶点的GO 富集分析结果见图4。

图4 GO 富集分析结果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

由KEGG 通路富集分析结果可知，以通路的显著性P<0.05 为筛选条件，8 个核心靶点共富集32 条通路。排除疾病信号通路，结合文献检索，共得到16 条与抑郁症相关的通路。通过Omicshare 平台中的气泡图进行可视化，如图5，圆点越大颜色越深，表明该通路富集的靶点数目越多，P值也越小。排名靠前信号通路的有催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）、ErbB 信号通路（ErbB signaling pathway）、GnRH 信号通路（GnRH signaling pathway）、黏着斑（Focal adhesion）等，表明预知子的活性成分通过调节多靶点、多通路起到抗抑郁的效应。

图5 预知子抗抑郁通路的气泡图Fig.5 Bubble diagram of anti-depression pathway of Akebiae Fructus

2.4 分子对接试验结果

以化合物-靶点网络中筛选的核心化学成分木通苯乙醇B、硬脂酸甘油酯、豆甾醇葡萄糖苷、齐墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛碱为配体，PPI 网络中筛选的核心靶点EGFR、MAPK1、MAPK8、SRC、HSP90AA1、AR、ESR1、CASP3 为受体，采用AutoDock vina 软件实施分子对接。一般认为分子对接的结合能越低，说明配体与受体相互作用越高。据文献[19]报道，若配体和受体的结合能≤−5.0 kcal·mol−1则被认为有效分子对接。由表2可知，除了硬脂酸甘油酯-ERFG的对接活性较弱外，其他47 对核心活性成分与靶蛋白（97.92%）均有较好的结合活性。其中，8 对核心活性成分与靶点（16.67%）的结合能均小于或等于−9.0 kcal/mol，显示出较强的结合活性。值的注意的是，蝙蝠葛碱-MAPK1、豆甾醇葡萄糖苷-MAPK1、木通苯乙醇B-MAPK8 和木通苯乙醇B-MAPK1 的对接活性最好，如图6可知，活性成分能够比较好地嵌入到靶蛋白的活性口袋中，形成稳定的构象。

图6 结合能最低的分子对接模式Fig.6 Docking mode with lowest binding energies

表2 预知子核心活性成分和核心靶点的结合能Table 2 Binding energies of kenerl compounds and targets of Akebiae Fructus

3 讨论与结论

本文采用网络药理学和分子对接揭示预知子抗抑郁作用机制。通过构建预知子“化学成分-靶点”网络，筛选得到6 个核心活性成分，包括木通苯乙醇B、硬脂酸甘油酯、豆甾醇葡萄糖苷、齐墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛碱。脑源性神经营养因子（brain -derived neurotrophic factor,BDNF）参与情绪和认知功能的关键脑回路中的神经元的生存、生长和维护。BDNF 的减少直接参与抑郁症的病理生理过程[20]。齐墩果酸能够增加海马BDNF 水平而具有抗抑郁作用[21]。西托糖苷和豆甾醇葡萄糖苷均属于甾体活性成分，在其四环核周围的官能团的作用下，具有广泛的生物活性。有报道指出豆甾醇葡萄糖苷的苷元在小鼠强迫游泳试验、尾部悬挂试验和川芎嗪所致上睑下垂、体温过低和运动抑制试验中通过缩短小鼠静止时间，增加小鼠运动活性、减少上睑下垂、拮抗小鼠体温下降而表现出显著的抗抑郁作用[22]。西托糖苷的苷元的同分异构体—β-谷甾醇通过增加中枢神经系统中的血清素和去甲肾上腺素水平而具有抗抑郁活性[23]。另外，分子对接结果显示木通苯乙醇B、豆甾醇葡萄糖苷、齐墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛碱均能较好地嵌合到核心靶蛋白的活性口袋中。

由PPI 网络筛选出8 个预知子抗抑郁核心靶点，包括EGFR、MAPK1/8、SRC、HSP90AA1、AR、ESR1、CASP3。EGFR 和HSP90AA1 在多种恶性肿瘤中高表达，而重度抑郁症在肿瘤患者中很常见，是普通人群的患病率的4 倍[24−25]。因此，研究者发现EGFR 突变型非小细胞肺癌通过介导炎症因子的产生抑郁情绪[26]，肝癌患者有中度/重度抑郁与HSP90AA1 上调相关[27]。Iñiguez 等[28]发现大鼠强迫游泳实验中，成年雄性Sprague-Dawley 大鼠海马中MAPK1 过表达能够诱导产生抗抑郁样行为。另外，MAPK8 是成年海马中神经发生的中枢抑制因子，同时也是焦虑和抑郁样行为的启动因子[29]。AR 可能通过改变miR-204-5p 的表达，调节BDNF的表达，从而影响慢性轻度应激型小鼠的抑郁样行为[30]。雌激素可调节神经递质的转换，提高血清素和去甲肾上腺素的水平，进而产生抗抑郁的作用。而雌激素的生物功能在很大程度上是通过细胞内激活其主要受体雌激素受体α（ESR1）和雌激素受体β（ESR2）发挥的。因此，雌激素受体的遗传变异在女性患抑郁症的易感性发挥着重要作用[31−32]。有研究指出谷氨酸能系统的功能障碍和突触可塑性的失调与抑郁症有关[33]。海马长期抑郁是一种活跃的突触可塑性，对空间记忆、情境性恐惧记忆和新颖性习得的巩固具有重要作用，通过线粒体激活caspase-3 是海马神经元长期抑郁和N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDR）内化所必需的[34]。分子对接显示以上大部分核心靶点与预知子核心活性成分具有较好的结合活性。

由KEGG 通路富集分析可知，核心靶点主要调控催乳素信号通路、ErbB 信号通路、GnRH 信号通路等信号通路。在催乳素信号通路中，有4 个预知子抗抑郁靶点参与调控。Jak/Stat 通路在催乳素信号转导中的核心作用。有文献报道，在慢性轻度应激抑郁症模型中，通过抑制JAK2-STAT5 信号通路的激活，从而降低催乳素受体（Prolactin receptor，PRLR）表达，抑制海马神经元凋亡，从而减轻慢性轻度应激诱导的抑郁[35]。抑郁症发病机制的单胺假说认为抑郁症是由大脑中突触单胺类神经递质（5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺）减少引起的[36]。基础研究表明神经营养因子Neuregulin 1 （NRG1）及其受体ErbB酪氨酸激酶调节中脑多巴胺（DA）传递和脑内多巴胺神经元的mglur1 依赖性长期抑郁[37]。有研究指出下丘脑激素GnRH 刺激垂体的黄体生成素和卵泡生成素的分泌，这两种激素反过来调节卵巢和睾丸的功能，而促性腺激素水平的变化会影响情绪，并有助于情感障碍的发展[38]。

综上所述，本研究运用网络药理学和分子对接方法初步探究预知子抗抑郁的药效物质基础，作用靶点和其调控的抗抑郁通路，发现预知子通过“多成分，多靶点，多通路”的作用机制而起到抗抑郁的效应，这为后续预知子抗抑郁的分子作用机制提供了新思路和新方法。