碳酸盐胁迫对瓦氏雅罗鱼血液中部分生理生化指标的影响

徐悦，米博瀚，赵雪飞，黄晶，梁利群

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；3.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

瓦氏雅罗鱼是我国北方知名的土著鱼，隶属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科的雅罗鱼属，亦称东北雅罗鱼，俗称华子鱼、滑鱼、白鱼，主要分布在黑龙江流域的各个水系，此外，黄河的下游、滦河、岱海以及内蒙古的达里湖等地亦有分布。内蒙古达里诺尔湖的瓦氏雅罗鱼可以耐受碱度53.57 mmol/L、pH 高达9.69 的恶劣水质条件[1]。窦新杰等[2]对瓦氏雅罗鱼的COI 序列分析可知，达里诺尔湖瓦氏雅罗鱼与黑龙江流域的松花江瓦氏雅罗鱼虽然亲缘较近，但已出现明显分化。生存于不同盐碱环境下的雅罗鱼，也使培育耐盐碱养殖新品种成为可能。

盐碱水是分布于陆地区域、矿化度大于1 g/L小于50 g/L 的非海洋性咸水资源，在自然界广泛存在，具有高pH、高碳酸盐碱度、主要离子比例失衡、水质类型多等特点。由于人畜无法饮用，农业无法直接利用，绝大多数处于闲置状态。开发盐碱水养殖，对节约利用土地资源，保证内陆水产养殖可持续发展具有重要意义[3]。水环境对于鱼类的血液循环系统有直接影响，鱼类的血液指标是反应鱼类生理活动和健康状态的重要参数。研究碱胁迫下瓦氏雅罗鱼血液生理指标的变化情况，有助于探究瓦氏雅罗鱼在碱胁迫下的生理变化。

本实验以碱水、淡水瓦氏雅罗鱼为研究对象，分别于30 mmol/L 与50 mmol/L 的NaHCO3溶液碱度水环境进行20 d 耐受试验。通过研究不同浓度碱胁迫对瓦氏雅罗鱼碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、尿素氮（BUN）、血氨（Amon）和乳酸脱氢酶（LDH）含量变化的影响，探讨不同瓦氏雅罗鱼在碱胁迫下生理指标变化情况，为探索雅罗鱼耐碱机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验鱼为分别采自内蒙古达里诺尔湖的瓦氏雅罗鱼（碱水组）F1亲本和松花江瓦氏雅罗鱼（淡水组）F1，共计120 尾。碱度耐受实验前实验鱼在循环可控水族箱（42.6 cm×28.4 cm×29.3 cm）暂养1 周。

1.2 碱胁迫实验

实验用水为过滤、曝气24 h 的自来水，水温为（20.5±1.5）℃，pH7.25，溶解氧为（7.5±0.42）mg/L，氨氮为0.26 mg/L。实验鱼以5 尾一组，分别置于0 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L 的碳酸盐碱水中。每组3 个平行试验，实验开始后每天测两次水质，并视水质情况换水，保持碳酸盐碱度恒定，氨氮气低于3 mg/L，耐受20 d 后取血液。

1.3 血液的采集与检测

碱胁迫实验20 d 后采集样品。用1 mL 无菌注射器从实验鱼尾静脉采血，置于无菌离心管中，4℃静置12 h，3 500 r/min 离心15 min，取上层血清置于-20℃低温冰箱保存备用。血清中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、尿素氮（BUN）、血氨和乳酸脱氢酶（LDH）的酶活测定均使用南京建成科技有限公司生产的试剂盒，利用Bio-Tek Synergy2多功能酶标仪测定[4]。

1.4 数据的测定

数据处理以碱浓度单素方差分析（One-Way ANOVA），用LSD 多重比较法进行组间差异显著性检验。试验数据以平均值±标准误（Mean±SD）表示，采用SPSS19.0 软件包进行统计分析，显著性水平取α＝0.05。

2 结果与分析

2.1 碱胁迫对碱性磷酸酶的影响

经20 d 碱胁迫，与对照组相比，FW 与AW 血清中碱性磷酸酶活性均有一定程度升高，FW 与AW 均在30 mmol/L 碱度下碱性磷酸酶活性高于50 mmol/L 碱度。FW 血清中AKP 活性（9.71±0.17、13.18±1.38 和12.4±0.52）与AW（10.56±0.45、8.72±0.83 和11.59±0.30）均为碱胁迫组高于对照组，AW 与FW 的血清AKP 活性在30 mmol/L 时在统计学上差异显著（P＜0.05），两个种群各实验组内AKP 活 性 差 异 均 不 显 著（P ＞0.05）；FW 的30 mmol/L 和50 mmol/L 碱度处理与对照组相比差异均显著（P＜0.05），AW 在两个碱度处理组间差异不显著（P＞0.05），但均与对照组存在显著性差异（P＜0.05）（图1）。

图1 各实验组碱性磷酸酶变化情况Fig.1 Changes of AKP in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.2 碱胁迫对酸性磷酸酶的影响

两个种群鱼血清中酸性磷酸酶变化情况与碱性磷酸酶有所不同。与对照组相比，FW 在碱胁迫后，血清中ACP 活性一定程度降低，且50 mmol/L碱处理组（91.41±3.75）要低于30 mmol/L 碱处理组（97.4±15.69），但两处理组与对照组均不存在显著差异（P＞0.05）；AW 则与FW 相反，两个碱处理组血清中ACP 活性均一定程度升高，50 mmol/L 处理组（107.15±4.24）低于30 mmol/L 处理组（117.39±10.22），仅30 mmol/L 组与对照组存在显著差异（P＜0.05）；相同实验组中，仅30 mmol/L 处理组中，两个种群鱼的血清ACP 含量差异显著（P＜0.05），其余均不存在显著差异（P＞0.05）（图2）。

图2 各实验组酸性磷酸酶变化情况Fig.2 Changes of ACP in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.3 碱胁迫对尿素氮的影响

20 d 碱度胁迫下，FW 和AW 的尿素氮变化情况相似，均为30 mmol/L 处理组尿素氮含量（5.73±0.78 和18.71±3.53）高于50 mmol/L 处理组（3.95±0.51 和13.97±0.79），但AW 波动幅度远大于FW，两个处理组AW 的血清BUN 含量均接近FW 的4倍；FW 的两个处理组与对照组间不存在显著差异（P＞0.05），AW 则均与处理组存在显著差异（P＜0.05）；同一碱度处理下，AW 与FW 也都存在显著差异（P＜0.05）（图3）。

图3 各实验组尿素氮变化情况Fig.3 Changes of BUN in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.4 碱胁迫对血氨的影响

两个种群鱼血清的血氨变化情况相似，均为处理组高于对照组，30 mmol/L 组（1919.93±63.92 和1638.58±178.72）高于50 mmol/L 组（1599.86±159.32 和1400.27±61.76），且FW 均高于AW；各实验组内，仅30 mmol/L 组中两个种群鱼血清的血氨含量存在显著差异（P＜0.05），FW 和AW 的两个处理组均与对照组存在显著差异（P＜0.05），FW 的两个处理组间也存在显著差异（P＜0.05），AW 的两个处理组间则不存在显著差异（P＞0.05）（图4）。

图4 各实验组血氨变化情况Fig.4 Changes of blood ammonia in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.5 碱胁迫对乳酸脱氢酶的影响

碱度胁迫下，FW 与AW 血清中的乳酸脱氢酶变化幅度均不明显。3 个实验组间的LDH 含量均不存在显著性差异（P＞0.05）（图5）。

图5 各实验组乳酸脱氢酶变化情况Fig.5 Changes of LDH in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

3 讨论

3.1 碳酸盐胁迫对瓦氏雅罗鱼血液中磷酸酶的影响

水体中的碳酸盐碱度对水生生物的多个生理进程都有影响，主要表现在组织功能、消化酶和免疫相关酶活性等方面。通常环境中的胁迫因素会导致鱼类出现应激反应，应激反应开始于组织和器官功能的变化，是生物应对或补偿胁迫源，从而导致远离稳态的生理反应，这种反应的速率或幅度在不同的个体之间可能存在差异，但其机制具有相似的特征[4]。ACP 是溶酶体的标志性酶，磷酸基团代谢产物通过磷酸酶进行转化和代谢，AKP 为ADP 转化为ATP 提供无机磷酸，是反映生物体免疫机能与健康状况的指标[5]。

本实验中，在高碱度条件下，淡水种与碱水种瓦氏雅罗鱼血清中的碱性磷酸酶活性均显著升高，说明两种瓦氏雅罗鱼均通过提高机体ACP 酶活性以适应高碱度环境。这与赵丽慧[6]、王卓等[7]的研究结果类似。研究发现，在50 mmol/L 组的磷酸酶活性要低于30 mmol/L，这可能是由于高碱胁破下瓦氏雅罗鱼为调节代谢所消耗的能量更多，机体所需的ATP 升高消耗了磷酸酶，从而导致了50 mmol/L 组瓦氏雅罗鱼的AKP 与ACP 低于30 mmol/L 处理组。舒超华等[8]在研究红耳龟盐胁迫下的生理指标中也有相似的效果。血清中的ACP 酶活力在30 mmol/L耐受升高后在50 mmol/L 处略微下降，说明在更高的50 mmol/L 碱胁迫下，ACP 酶活性被抑制。淡水种瓦氏雅罗鱼的ACP 在高碱度下要显著高于碱水种瓦氏雅罗鱼，说明碱水种相对于淡水种瓦氏雅罗鱼对碳酸盐碱度的适应性较强，高碱度胁迫下磷酸酶活性也具有很好的恢复功能。

3.2 碳酸盐胁迫对瓦氏雅罗鱼血液中尿素氮、血氨和乳酸脱氢酶的影响

尿素氮是动物体内蛋白质代谢的主要代谢产物，可以反映肾脏的健康状况。血清中尿素氮是衡量动物体内蛋白质代谢和氨基酸平衡的一个重要指标。通常，较低的BUN 含量表明氨基酸平衡较好，机体蛋白质合成率较高[9]，血清尿素氮过高，则会使氮通过尿液排出体外[10]。

有研究表明在碳酸盐水体中，鱼体内外离子浓度的变化会导致体内NH4+的堆积[11,12]。本研究中，与0 mmol/L 碱度环境下相比，两种瓦氏雅罗鱼在30 mmol/L 和50 mmol/L 碱度下尿素氮均显著增长，且碱水种瓦氏雅罗鱼的尿素氮数值显著高于淡水种雅罗鱼。与张晓莹等[13]发现异育银鲫在高氨氮环境下异尿素氮数值显著升高的研究类似。鱼体内的氨经氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）催化产生氨甲酰磷酸等一系列生化反应，最终产生尿素[14,15]。常玉梅等[16]测定了不同碱度下瓦氏雅罗鱼血浆游离氨基酸的变化，发现达里湖雅罗鱼在高碱胁迫下血浆中非必需氨基酸的含量随着碱度的升高,呈明显上升趋势，说明其蛋白代谢受到了高碱度的影响。赖氨酸的含量与水体碱度呈现“U”形关系，即30 mmol/L碱度组含量低于对照组和高碱度组50 mmol/L，而血清尿素氮则呈现“倒U”形。说明血清尿素氮含量可能与某几种氨基酸的合成或代谢有一定的联系。

鱼类盐碱代谢的基础是排氨[17]，相比较于淡水种雅罗鱼，碱水种雅罗鱼血液中的氨明显低于淡水种，且尿素氮高于淡水种雅罗鱼。说明碱水种通过尿液向体外排除氮的能力要明显强于淡水种，碱水种能通过这一方式减少体内部分有害氮的堆积，使自身对外界恶劣环境具有更强的适应能力。此外，两种雅罗鱼在50 mmol/L 碱度下尿素氮和血氨也出现了的低于30 mmol/L 的情况。何强等[18,19]研究的测定类似，碱水雅罗鱼的血氨含量在两个处理组中虽然有一定的波动，但并不存在显著差异（P＞0.05），而淡水雅罗鱼两个处理组相互之间存在显著差异（P＜0.05），血氨含量波动较大，说明碱水种能够通过保持体内一定范围的氨氮含量适应高盐碱环境，而淡水种则欠缺这种适应能力。

乳酸脱氢酶是生物体糖代谢无氧酵解过程中重要的调节酶，可催化无氧酵解产生的乳酸与丙酮酸之间的相互转化。在相关的研究中，陶易凡等[20]研究表明，短期的高pH 胁迫会使克氏原螯虾Procambarus clarkia LDH 酶活性升高。崔东遥等[21]对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius 面对海水酸化的实验发现，中间球海胆通过调节SiLDH 基因的表达和LDH 活性来缓解海水酸化带来的负面影响。本实验中瓦氏雅罗鱼乳酸脱氢酶活性变化不显著，有可能是瓦氏雅罗鱼的耐碱机制使乳酸脱氢酶活性保持稳定，但是不能从结果推断两种瓦氏雅罗鱼的生理机制相同，乳酸脱氢酶在瓦氏雅罗鱼耐碱方面的功能有待进一步研究。

3.3 结论

碳酸盐胁迫对于瓦氏雅罗鱼血液中的磷酸酶活性、血氨和尿素氮含量有明显的影响。在碱胁迫条件下，两种雅罗鱼碱性磷酸酶活性显著高于淡水对照，碱水雅罗鱼酸性磷酸酶活性显著升高，淡水雅罗鱼变化不明显。推断磷酸酶参与碱水雅罗鱼的耐碱机制。碱胁迫下碱水雅罗鱼尿素氮指标显著升高，淡水雅罗鱼尿素氮指标变化不显著，另外两者血氨指标均有升高。推断碱水雅罗鱼应对碱胁迫启动排氨代谢导致尿素氮升高，而淡水雅罗鱼血氨升高尿素氮不升高使其体内有害氮堆积有可能会造成损伤。

综上所述，碱水雅罗鱼和淡水雅罗鱼对于碳酸盐胁迫的应激性和适应能力有一定的不同，达里湖瓦氏雅罗鱼可能会启动一些特殊的机制来应对高碱度水环境。达里湖瓦氏雅罗鱼对高碱水的适应能力强于松花江瓦氏雅罗鱼。