丽江人工栽培羊肚菌病害调查及病原鉴定

潘启强， 李云霞， 陈健鑫， 吕则佳， 伍建榕，*， 马焕成

(1.西南林业大学 生物多样性保护学院， 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室， 云南 昆明 650224； 2.西南林业大学 林学院， 国家林业局 西南地区生物多样性保育重点实验室， 云南 昆明 650224)

引言

【研究意义】羊肚菌〔Morchellaesculenta(L.) Pers.〕又称羊肚蘑、羊肚菜，因其外形与羊肚相似而得名[1]，子实体呈蜂窝状，属于子囊菌门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)[2]。羊肚菌的营养价值高，据测定，羊肚菌含粗蛋白20%、粗脂肪26%、碳水化合物38.1%[3]，至少含有17种氨基酸，特别是谷氨酸含量高达83.44 mg/g[4]，是优质蛋白质来源。野生羊肚菌全世界都有分布，在我国的分布也很广，主要集中在西藏、云南、四川、新疆、山西、河南、陕西、甘肃等地，但是野生羊肚菌数量相对稀少，因此人工栽培满足市场需求成为必然。【前人研究进展】1980年，美国Ower发表了野外羊肚菌人工工厂化驯化栽培技术的专利[5]，为人工栽培羊肚菌奠定了理论基础。21世纪初，谭方河[6]在驯化栽培研究中发现影响羊肚菌人工栽培的2个重要条件：一是易出菇羊肚菌品种，二是外源营养袋补料技术。这两项重要条件能够保证羊肚菌人工栽培的稳定增产，同时极大的促进了我国羊肚菌人工栽培技术的飞跃。由于羊肚菌人工栽培技术不断进步，种植羊肚菌的菇民增多。目前，中国已成为世界上羊肚菌人工栽培面积最大的国家。2016年，我国羊肚菌栽培面积达1 600 hm2。2017年，人工栽培面积近4 666.7 hm2，鲜菇产量约100 kg/667m2，年产量近 7 000 t，2018—2019年全国栽种面积已达8 000～9 333 hm2，羊肚菌已成为近年来我国食用菌最畅销的栽种品种之一[7]。丽江是云南省羊肚菌的主要产区之一，丽江市属于低纬暖温带高原山地季风气候，年温差小而昼夜温差大，兼具有海洋性气候和大陆性气候特征，利于开展羊肚菌的人工栽培。近年来，羊肚菌的人工栽培技术取得较大进展，栽培面积不断扩大，同时羊肚菌的病害问题也逐渐凸显。【研究切入点】镰刀菌一旦危害羊肚菌，病害能够在短时间内迅速大面积爆发，且通常聚集连片发生，最终导致羊肚菌萎蔫、畸形，严重影响其品质。截至目前，有关镰刀菌危害羊肚菌的研究已有文献报道，但对丽江栽培羊肚菌的研究尚未有相关文献报道。【拟解决的关键问题】对丽江市永胜县人工栽培羊肚干腐病进行普查和专题调查，并统计相关病害的发病率和病情指数，采集羊肚菌病害标本，结合形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定，以确定引起羊肚菌干腐病的病原，为人工栽培羊肚菌干腐病的综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本采集 分别于2018年3月、5月和9月在丽江市永胜县羊肚菌人工种植基地采集病症病状明显的羊肚菌子实体，对羊肚菌干腐病的发生数量进行调查统计，观察病害症状，并做好相关记录。标本风干后带回实验室进行后续试验。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200 g，葡萄糖(或蔗糖)20 g，琼脂15～20 g，链霉素30 mg，水1 000 mL，pH自然，121℃下灭菌30 min。

1.1.3 试剂 分离培养试验使用的试剂有蒸馏水、马铃薯、葡萄糖、蔗糖、琼脂、75%酒精。分子生物学试验使用的试剂有超纯水、液氮、TAE缓冲液、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、2×Taq Master Mix、核酸染料，真菌引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′。

1.2 方法

1.2.1 发病率及病情指数调查 对丽江市永胜县涛源镇、鲁地拉镇和三川镇30块羊肚菌人工种植基地发生的羊肚菌干腐病进行发病率和病情指数调查，并做好相关记录。羊肚菌干腐病的专项调查，采用五点取样法抽样调查，以株为单位进行随机抽样调查，统计发病株数和总株数并计算发病率，根据羊肚菌腐烂面积进行分级(表1)，发病率及病情指数计算公式如下。

发病率=(病株数/调查总株数)×100%

病情指数=∑[(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)]×100

表1 羊肚菌干腐病分级标准

1.2.2 病原菌的分离

1) 组织分离 。在灭菌的1 L PDA培养基中加入30 mg链霉素，制成PDA平板。取病害标本的病健交界处，先用75%酒精再用0.1%升汞进行消毒，最后用无菌水冲洗3次，灭菌吸水纸吸干组织块表面的水分，采用五点法将处理过的组织块放在备用的PDA培养基平板上，贴好封口膜，3次重复，25℃条件下倒置培养[8]。待菌丝长出后，挑取少量菌丝到新的PDA培养基中纯培养，然后将纯菌落挑入PDA试管斜面中培养3～4 d后，置于4℃冰箱中保存待用。

2) 纯化培养。在超净工作台中用接种针轻轻挑取发病部位的霉状物到PDA培养基上，25℃培养。待菌丝长出后，挑取少量菌丝进行2～3次纯化，然后将纯菌落挑入试管斜面中培养3～4 d后，置于4℃冰箱中保存待用[9-10]。

1.2.3 致病性的测定 将分离纯化保存后的病原菌菌株接在PDA培养基上，25℃恒温培养进行活化，然后使用1 mm打孔器取得病原菌菌饼，用消毒的手术刀在健康羊肚菌子实体表面划十字切口，将菌饼接种到十字切口位点上，在自然条件下培养，以灭菌的PDA菌饼为空白对照组，每处理重复3次，观察其症状表现，待羊肚菌发病后再将病原菌进行分离培养，观察病原菌形态特征并再次进行分子鉴定，以确定与接种菌株的一致性[11]。

1.2.4 病原菌的形态学鉴定 在真菌生长期间观察菌落形态特征，培养7 d时挑取菌落制成临时玻片，在显微镜下观察菌丝形态、孢子大小等特征，并进行拍照记录。对于挑取菌落观察不符合要求的菌株采用玻片培养检视法进行鉴定，在PDA平板上45°斜插灭菌的盖玻片，接菌后25℃培养，菌落始产孢时取出盖玻片，置于滴有1滴蒸馏水的载玻片上制作成临时玻片，显微镜下观察菌丝、孢子等结构并进行拍照记录。

1.2.5 病原菌的分子鉴定 用75%酒精杀菌消毒挑针并于火焰上灼烧，挑取黄豆大小的菌丝置于离心管中，勿挑取培养基，用镊子夹取盖紧离心管后放于液氮中，冷冻后取出用研磨棒磨碎。采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原真菌DNA，转录区扩增采用真菌通用引物ITS1和ITS4，PCR扩增体系：2×Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，ITS11.5 μL，ITS41.5 μL，DNA 2 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸50 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存[12]。将扩增序列送至华大基因公司测序。

1.2.6 系统发育树构建 测序后的序列与从GenBank下载的序列进行比对。

1) 最大简约法。多重比对由在线MAFFT version 7自动进行，在BioEdit中手动调整。系统发育分析方法采用最大简约法(MP)分析，并在PAUP4.0中执行树型构建过程，最后使用FigTree对树进行可视化和布局编辑。

2) 最大似然法。利用ClustalX进行多重比对，在BioEdit中手动调整。系统发育分析方法采用最大似然法(ML)分析，并利用raxmlGUI 2.0-beta执行树型构建过程，使用FigTree对树进行可视化和布局编辑。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌干腐病发病情况

2.1.1 症状 由图1可见，羊肚菌干腐病通常聚集连片发生，初期主要在羊肚菌子实体表面出现白色丝状物，导致发病部位凹陷、萎焉，被侵染的子实体坏死、畸形。

图1 羊肚菌干腐病症状

2.1.2 发病率及病情指数 调查羊肚菌6 734株，其中干腐病发病株数为1 650株，发病率为24.51%。根据子实体受害面积进行分级，统计各级株数，以样地1为例，0级、1级、2级、3级和4级的株数分别为508株、105株、42株、11株和7株，病情指数为9.3(表2)；涛源镇、鲁地拉镇和三川镇10块样地的平均病情指数分别为22.0、16.2和19.8；永胜县3个镇羊肚菌干腐病的病情指数平均为19.3。

表2 羊肚菌干腐病病情指数

2.2 病原菌的分离

从发病羊肚菌的病健交界处分离到3株菌，编号为YL1～YL3。由图2可见，YL1在PDA培养基上菌落正面白色，气生菌丝发达、絮状，菌丝光滑、无色、无隔；YL2、YL3在PDA培养基上菌落正面白色偏淡黄色、菌落隆起，繁茂，较厚，致密。

图2 发病羊肚菌分离菌落的形态

2.3 病原菌的致病力

YL1、YL2和YL3株对羊肚菌均有致病力。由图3可见，发病症状主要表现为2 d后羊肚菌子实体表面出现白色菌丝，有的出现在菌盖顶部，感染部位组织停止生长发育。7 d后发病部位凹陷、萎焉，子实体坏死，畸形。

图3 病原菌在羊肚菌的致病力

2.4 病原菌的形态鉴定

YL1在PDA培养基上菌落正面白色，气生菌丝发达、絮状，菌丝光滑、无色、无隔，菌落背面为淡黄色。分生孢子串生，长椭圆形(图4)。根据形态学特征，参照魏景超的《真菌鉴定手册》[13]，将YL1初步鉴定为拟青霉属(Paecilomycessp.)。YL2、YL3在PDA培养基上菌落正面白色偏淡黄色、菌落隆起，繁茂，较厚，致密，菌落背面为淡黄色。分生孢子无色透明，大型分生孢子镰刀形，稍弯曲，两端渐细，具2～5个隔膜，大小为(12.5～30.0)μm×(2.5～5)μm。根据形态学特征和文献[14-15]，将YL2、YL3初步鉴定为镰孢属真菌(Fusariumsp.)。

图4 分离真菌的形态特征

2.5 病原菌的分子鉴定

以Mariannaeacamptospora序列作为外类群，GenBank中的登录号为AY624202，基于ITS序列采用最大简约法与最大似然法构建拟青霉属(Paecilomyces)和镰刀菌属(Fusarium)的系统发育树可见，YL1、YL2、YL3分别与Paecilomycespenicillatus、Fusariumavenaceum、Fusariumredolens相似度最高(图5)。因此，YL1鉴定为长毛拟青霉(P.penicillatus)，YL2鉴定为燕麦镰刀菌(F.avenaceum)，YL3鉴定为芬芳镰刀菌(F.redolens)。

图5 基于ITS序列采用最大简约法构建的系统发育树

3 讨论

据报道，在中国栽培的梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)上发生了由变红镰刀菌(Fusariumincarnatum)、木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)[16]和长毛拟青霉(Paecilomycespenicillatus)引起的白霉病[17]。拟青霉属的长毛拟青霉常常能引发羊肚菌发生白霉病，王耀进[18]也通过形态学、分子学鉴定和科赫氏验证，引起羊肚菌白霉病的病原真菌为拟青霉(Paecilomycespenicillatus)，与研究中导致丽江人工栽培羊肚菌发病的病原菌结果一致，均为长毛拟青霉(Paecilomycespenicillatus)。

镰刀菌(Fusariumspp.)是一类世界性分布的真菌，可在土壤中越冬越夏，还可侵染多种农作物，也是一种羊肚菌子囊果病原菌。镰刀菌对羊肚菌子囊果初期以危害菌柄为主，后期能侵染菌帽，侵染部位产生白色菌丝物，在22℃以上的高温高湿天气，可在短时间内侵染整个羊肚菌菌株，并具有大面积扩散暴发的危害，最终导致羊肚菌萎蔫、畸形，严重影响其品质。镰刀菌可产生镰刀菌毒素，因此被镰刀菌感染的羊肚菌不能再继续食用[19]。丽江人工栽培羊肚菌的症状表现与上述基本一致，最终导致羊肚菌萎蔫、畸形。羊肚菌的致病菌已被鉴定出有变红镰刀菌(F.incarnatum)和木贼镰刀菌(F.equiseti)。何培新等[20]对羊肚菌内生真菌鉴定中发现有腐皮镰刀菌(F.solani)与串珠镰刀菌(F.moniliforme)。余苗等[21]也认为，尖孢镰刀菌(F.oysporum)和亚洲镰刀菌(F.asiaticum)可能为羊肚菌镰刀菌病或霉菌性枯萎病的病原菌。而研究中YL2燕麦镰刀菌(F.avenaceum)，YL3芬芳镰刀菌(F.redolens)均为镰刀菌属的真菌，产生的症状相同。因此，YL2燕麦镰刀菌(F.avenaceum)和YL3芬芳镰刀菌(F.redolens)是丽江市羊肚菌人工种植基地发生干腐病病害的病原菌，燕麦镰刀菌(F.avenaceum)和芬芳镰刀菌(F.redolens)与现在已报道的羊肚菌病原不是同一种，但为镰刀菌属，可能是由于地域环境差异导致不同。

研究确定了丽江市羊肚菌人工种植基地发生干腐病病害的病原菌有长毛拟青霉、燕麦镰刀菌和芬芳镰刀菌，此3种病原皆为羊肚菌干腐病的病原，感染这些病原后终会导致羊肚菌萎焉、畸形、坏死，降低了丽江当地羊肚菌的经济价值。现已知丽江羊肚菌干腐病的病原后，可为之后丽江人工栽培羊肚菌发生干腐病病害防治提供理论依据。但目前防治羊肚菌干腐病尚未有高效且无害的药剂成果，建议广大种植羊肚菌的菇农们做好相关的人工防护措施，如在羊肚菌播种前要对土壤进行处理、避免高温高湿环境、选择以环境温度低于20℃为最佳播种时间、见白就采，在羊肚菌出菇阶段发生真菌病害后，直接将羊肚菌摘除，带离产区。

4 结论

调查结果显示，丽江市永胜地区3个镇30块人工栽培的羊肚菌干腐病发生严重，平均干腐病发病率为24.51%，病情指数为19.30。羊肚菌作为食用菌，一旦发病，病害能够在短时间内迅速大面积爆发，且通常聚集连片发生。致病性测定试验中导致双孢菇发病的病原真菌菌株共有3株，病原真菌菌株有YL1、YL2和YL3，结合形态学特征和分子鉴定，YL1鉴定为长毛拟青霉，YL2鉴定为燕麦镰刀菌，YL3鉴定为芬芳镰刀菌。