云贵高原典型湖滨湿地好氧甲烷氧化细菌群落结构和数量的时空动态

夏品华,林 陶

贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室, 贵阳 550001

甲烷(CH4)是大气中仅次于CO2的第二大温室气体,对全球温室效应的贡献率达30%—40%[1]。CH4在大气中的浓度已经从工业化以前的体数分数为7.15×10-6增长到现在的体数分数为1.77×10-5。大气中增加的CH4主要来自人类的生产活动和自然生态系统释放[2]。湖泊生态系统是大气CH4的重要源,贡献了自然排放总量的16%[3]。通常情况下,厌氧土层产甲烷菌产生的CH4约30%—90%在释放到大气之前被甲烷氧化菌(Methanotrophs)消耗掉[4-5],甲烷氧化菌以CH4作为唯一碳源和能源,在环境中起着CH4生物过滤器的作用[6-7]。

环境中存在两类截然不同的甲烷氧化菌,好氧甲烷氧化细菌(methane-oxidizing bacteria,MOB)和厌氧MOB。其中,好氧MOB是甲基营养细菌(Methylotrophic bacteria)的一个分支[8],它们属于变形菌门、疣微菌门和NC10门[9]。好氧MOB的生理和多样性已经得到了很好研究[10]。目前自然湿地中仅发现变形菌门的分布,可分为Ⅰ型和Ⅱ型[11],其中Ⅰ型属于γ-变形菌纲的甲基球菌科,现已发现了15个属,Ⅱ型属于α-变形菌纲,包括Methylocystaceae和Beijerinckiaceae 两个科,前者有Methylocystis和Methylosinus属,后者有Methylocapsa、Methylocella和Methyloferula属[12]。通常以甲烷氧化单加氧酶功能基因(pmoA)为生物标志物,结合RFLP、测序等技术,对湖泊、沼泽等各种环境中好氧MOB群落组成进行了大量卓有成效的研究[13-15]。

湖滨湿地是湖泊生态系统重要组成部分,是湖泊CH4排放的热区[16-17]。湖滨湿地急剧变化的水文、植被和土壤理化[18,19]对好氧MOB群落数量和组成、结构势必会产生深刻的影响,进而影响CH4的产生、氧化、传输和排放,致使湖滨湿地CH4排放呈现高度的时空异质性。然而,对高原湖泊湖滨带的关注较少,以往的研究大多集中在开放水域[20-22]。湖滨湿地沉积物好氧MOB群落与环境因素之间的联系仍然不清楚,云贵高原湖滨湿地好氧MOB群落组成及分布鲜见报道。

云贵高原湖泊资源丰富,是我国三大高原湿地之一。虽然云贵高原湖泊沉积物中好氧MOB 的分布最近几年已有少量报道[13,22],但尚不清楚湖滨湿地沉积物的好氧MOB群落如何随季节和环境变化而变化。该研究的主要目的是揭示湖滨带好氧MOB群落时空动态及其与环境的关系。本文以云贵高原湖泊湿地的典型代表——草海为研究对象,以pmoA为标记物,运用q-PCR、T-RFLP、和基因文库构建等方法对贵州草海湖滨带好氧MOB数量和群落结构进行了研究,分析了驱动好氧MOB群落时空动态的关键因子,研究结果丰富了人们对高原湖滨湿地好氧MOB群落生态学的认识。

1 材料与方法

1.1 样点描述与采样

贵州草海国家级自然保护区位于贵州省威宁彝族回族苗族自治县县城西南侧,地处云贵高原乌蒙山区腹地[23]。其地理坐标介于26°47′35″—26°52′10″N和104°9′23″—104°20′10″E之间。海拔2171.7 m,属亚热带高原季风气候,冬暖夏凉、冬干夏湿的气候特征,年均气温10.6 ℃,年均降水量950.9 mm,相对湿度79%。最深处为5 m。物种丰富,水生维管束植物68种,共记录鸟类246种[24]。

根据草海湖滨湿地水文和植被分布格局,从湖滨宽敞水域至湖岸设置了四个采样梯度,即长期淹水宽敞水域区沉水植被眼子菜(P)湿地(104°15.255′E,26°50.899′N)、长期淹水浅水区挺水植被水葱(E)湿地(104°15.910′E,26°50.697′N)、干湿过渡区藨草(T)湿地(104°16.504′E,26°50.610′N)和偶尔积水区灯芯草(V)湿地(104°16.805′E,26°50.451′N),分别在2月、5月、7月和11月进行采样,设置3—4个重复,分0—10 cm、10—20 cm和20—30 cm三层,记录水深、温度、植被高度等；土壤低温保存带回实验室后,一部分风干测定理化指标,土壤理化指标参照《土壤农业化学分析方法》测定。另一部分置于-80℃冰箱用于好氧MOB分子分析。

1.2 DNA提取与pmoA基因扩增及纯化

采用土壤DNA提取试剂盒(Bio 101 Inc., Calif., USA),取0.5 g土壤鲜样,按照说明书步骤进行操作。DNA含量用NanoDrop® ND-1000核酸定量仪(Nanodrop technologies)测定,在-80 ℃贮存。采用好氧MOB的特异性引物A189f (5′-GGN GAC TGG GAC TTC TGG-3′)和mb661r(5′-CCG GMG CAA CGT CYT TACC-3′)[16]。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性5 min；接着35个扩增循环：94℃变性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸5 min。扩增的PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒Agarose Gel DNA Purification kit (Promega,USA),按说明书进行pmoA基因的回收纯化。

1.3 实时荧光定量

pmoA基因定量分析引物同上,反应体系为10 μL,包括1μL DNA 模板、5 μL SYBR Premix Ex TaqTM,上、下游引物各0.1 μL (20 μmol/L) 和3.8 μL的灭菌双蒸水,扩增条件同上。标准曲线相关系数R2为0.999,满足绝对定量要求。

1.4 pmoA基因克隆文库构建及RFLP分析

纯化后的pmoA基因片段按说明书的方法与pMD 18-Tvector(Takara,Japan)连接。16 ℃过夜连接后,转化入E.coli DHS感受态细胞。转化产物涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上,37 ℃下培养24 h,通过蓝白斑筛选方法筛选重组子。挑取白色阳性转化子构建克隆文库,克隆文库用LB(Amp+)平板4 ℃保藏,测序由北京六合华大基因公司进行,测序引物为载体通用引物T7。

为检查整个克隆文库的有效性,在所构建的各个克隆文库中随机挑取100个白色克隆子进行菌落PCR验证。按照厂家说明书的方法对阳性克隆的PCR产物进行MspI(Takara,Japan)酶切。酶切消化产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段。用ABI3730遗传分析仪中进行毛细管电泳；取荧光强度50RFU为基线,用Genemapper软件(Version 3.7 Applied Biosystems Incorporated,USA)计算大于基线的峰高和出峰处的T-RF(末端标记限制性片段)长度。将T-RF介于50 bp和550 bp之间的峰面积进行标准化处理,计算相对应的丰度。

1.5 基因的序列分析和系统发育树的构建

将克隆对应的每一个pmoA基因序列与GenBank数据库中己知序列进行BLAST比较,鉴定与克隆序列亲缘关系最近的种属。并从数据库中获取相关的pmoA基因序列,采用Clustal X1.83软件进行多重比对,用MEGA 6软件包中的Neighbor-Joining法,设自展值为1000次,构建系统发育树[25]。

1.6 数据处理与分析

PCoA、相关性及蒙特卡洛检验用R(3.5)进行分析,制图软件采用Origin 9.0。

2 结果

2.1 水文、植被和土壤特征

表1 环境因子

2.2 pmoA功能基因数量的时空分布

草海湖滨湿地好氧MOBpmoA功能基因数量丰富,在1.78×107—2.73×108拷贝数/g干沉积物之间(图1),具有明显的时空异质性。宽敞水域深水区和干湿交替区高,而浅水区和偶尔积水区低；在0—30 cm垂直剖面上,干湿交替区具有明显的从表层至底层逐渐减低外,其它无明显变化规律和趋势。季节变化明显,大小依次为7月>5月>11月>2月。pmoA功能基因数量与温度极显著正相关(P<0.01),与其它因子如水深、NO3-N等相关性不显著(P>0.05)。

图1 pmoA基因时空分布特征Fig.1 Spatio-temporal distribution of pmoA gene abundanceP: 眼子菜湿地Potamogeton；V: 灯芯草湿地Validus；T: 藨草湿地Triqueter；E: 水葱湿地Effusus

2.3 酶切片段T-RFs的分布及甲烷氧化细菌鉴定

采用T-RFLP方法,对4种水位梯度下好氧MOB群落进行分析,共检测到10个T-RFs(图2)。在10个T-RFs中以75 bp、241 bp、243 bp和348 bp为主,其中75 bp的T-RFs主要分布在宽敞水域眼子菜湿地和浅水区水葱湿地,随着水位的降低而减少(P<0.01),与之相反,241 bp和348 bp的T-RFs主要分布在干湿交替区藨草湿地和偶尔集水区灯芯草湿地,随着水位的降低而升高； 243 bp的T-RFs在不同水位梯度都有分布,且比较均匀；不过一些T-RFs对水文条件具有强烈的选择性,如59 bp、140 bp和188 bp的T-RFs只分布在宽敞水域眼子菜和浅水区水葱湿地,而234 bp的T-RFs只分布在干湿交替区藨草湿地和偶尔集水区灯芯草湿地。这表明草海湖滨湿地好氧MOB群落组成具有空间异质性。

图2 pomA T-RFs相对数量Fig.2 Relative abundanc of pmoA T-RFs

选择具有不同T-RF片段的沉积物样品构建克隆文库,进行测序分析,构建系统发育树。 该序列在系统发育上与I型和II型相关(图3)。I型好氧MOB属于γ-变形菌纲的Methylococcaceae 科,II属于α-变形菌纲的Methylocystaceae。75 bp的T-RF片段代表Methylococcaceae (Methylococcus,Methylocaldum)。241 bp的T-RF 片段代表Methylocystacea (MethylocystisandMethylosinus),2413 bp的T-RF片段代表Methylocystacea (Methylosinus)。

图3 pmoA基因序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of pmoA gene sequences

2.4 好氧MOB群落时空动态

好氧MOB的主坐标分析结果见图4。草海湖滨湿地4个水位梯度的31个样品可以聚为4类,表明不同水位梯度下好氧MOB群落组成不同。基本上是深水区样品聚为一组,而浅水区组成另一组,干湿交替区和偶尔积水区的样品也各自成簇,但也存在一些交叉,如深水区的MP10与浅水区的聚在一组,干湿交替区JT20与落干区的聚为一组,呈现出明显的过渡性分布特征。此外,我们还发现在季节上却不能很好地进行分组,好氧MOB群落组成的分布不随季节变化而改变。表明草海湖滨湿地好氧MOB具有显著的空间变化。好氧MOB群落与环境因子的相关性分析和蒙特卡洛检验见图5。pH是最主要的环境因子,其次是含水量(SWC)和溶解性有机碳(DOC),水深的影响也很显著,但温度、硝态氮和二价铁的影响不显著。

图4 好氧MOB群落的主坐标分析(PCoA)Fig.4 Principal coordinate analysis (PCoA) for MOBF：2月；M：5月；J：7月；N：11月

图5 好氧MOB群落与环境因子的相关性及蒙特卡洛检验Fig.5 Correlations between MOB community and environmental factors and montel testWL:水深；SWC：土壤含水量；ST：土壤温度；DOC：可溶性有机碳

3 讨论

高原湖泊湿地是我国湿地重要组成,主要分布在青藏高原、云贵高原和蒙新高原等高原区,是我国甲烷排放的重要源[26]。湖滨湿地是湖泊生态系统的重要组成部分,是湖泊甲烷排放的热区[16]。以往研究表明高原湖滨湿地甲烷排放具有高度的时空异质性,但关于高原湖滨湿地好氧MOB群落组成及其时空动态缺乏了解。本文采用实时荧光定量PCR和克隆测序,以云贵高原典型湖滨湿地草海为代表,研究了4种不同水文条件下沉积物中好氧MOB丰度和群落组成时空动态。研究结果对了解湖滨湿地甲烷温室气体排放的微生物作用机制具有重要意义。

3.1 好氧MOB数量与群落组成的时空动态

沉积物中好氧MOB数量的研究已有许多报道,但目前对不同区域不同类型湿地沉积物中的数量分布格局了解不够。本研究中草海湖滨湿地pmoA功能基因数量在1.78×107—2.73×108拷贝数/g干沉积物之间,与我国青藏高原若尔盖湿地(107—108拷贝数/g干沉积物)[27,28]以及云贵高原的其它湿地如拉市海、海西湖、长桥湖、天池等近10个湖泊湿地[22]相似；但略低于我国三江平原湿地(108—109拷贝数/g干沉积物)[29],以及云贵高原部分浅水和富营养化的湖泊,如剑湖湿地1.67×1010和普者黑湿地3.05×109[22]；高于北方湖泊(boreal lake)岸边带湿地105[20]和滇池沉积物104—107拷贝数/g干沉积物[15]和日本琵琶湖沉积物中MOP数量(8.8×106—5.8×107)[30]。高原湖泊较高的好氧MOB数量与其相当高的甲烷量有关[13],因为好氧MOB的生长依靠甲烷提供碳源和能源。

草海湖滨湿地沉积物中好氧MOB数量具有明显的时空异质性。这与以往的一些研究一致,滇池沉积物中好氧MOB数量在(8.71×104—2.07×107)之间变化[13]；然而,Rahalkar[14]对Constance 湖的研究表明,沉积物中好氧MOB数量在空间上没有差异(2.07×107—4×107)。本研究中从宽敞水域至偶尔积水区沿着水位的降低好氧MOB数量先降低后增加再降低的波浪式分布,其在浅水区最低,干湿交替区最高。干湿交替区由于干湿交替营造了好氧缺氧环境,为好氧MOB生提供适宜生长条件。季节上呈现出春夏季节高于秋冬季节的趋势,这可能是由于春夏季节较高的温度更适宜于好氧MOB生长的缘故。湖滨湿地沉积物中好氧MOB数量变化可能是其甲烷通量高度时空异质性的一个重要成因。

湖泊沉积物中好氧MOB群落具有明显的时空异质性[20,21,32]。本研究也证实了这一点,草海湖滨湿地沿着水位梯度的变化好氧MOB群落组成和结构显著不同,从宽敞水域至偶尔积水区甲烷菌由type I 好氧MOB向 type II 好氧MOB演替。宽敞水域深水区和浅水区沉积物中type I和type II好氧MOB都有分布,其中宽敞水域深水区中type I型methanotrophs (Methylococcus,Methylocaldum)主导,而浅水区沉积物中type I和type II好氧MOB数量相当。这与以往的研究结果一致,长期积水湿地环境中,I型好氧MOB通常超过II型好氧MOB[13,20]。Constance 湖沉积物中I 型好氧MOB是II型的4倍[14]。与II型好氧MOB相比,I型好氧MOB通常对CH4的亲和力较低[28],且在CH4较高的地方具有较强的竞争优势[13]。宽敞水域深水区沉积物中有机质、氮等营养物质丰富,且其厌氧环境有利于CH4的产生,这为低甲烷亲和力的I型好氧MOB提供了物质保障。因此,淹水和富营养环境的沉积物中,就形成I型好氧MOB为优势的分布格局。

干湿交替区藨草湿地和偶尔集水区灯芯草湿地好氧MOB群落由II 好氧MOB (Methylocystis,MethylosinusandMethylosinus)主导。在干旱环境中Type II 好氧MOB能很好生长并常常占据主导地位[28]。可以从以下两个方面解释较干环境利于II 型好氧MOB。首先,II 型好氧MOB对CH4的亲和力比I型好氧MOB高[31]。另一个原因是II 型好氧MOB是K生活对策[33],忍耐干旱环境能力比I型好氧MOB强。II型好氧MOB,例如甲基胞囊菌属,可以形成抗旱的囊胞[34],可以在不利的条件下长期生存[38]。因此,II型好氧MOB在湖滨湿地相对干旱的区域就形成了优势。

湖滨湿地不同水位梯度下好氧MOB群落组成明显不同,暗示湖滨湿地不同水位梯度下CH4的氧化可能由不同类型的好氧MOB主导。He等人[36]采用同位素探针技术,证明了湖泊沉积物中甲烷的氧化主要由I型好氧MOB驱动。据此推测,好氧MOB群落空间分布差异可能是导致湖滨湿地较高的甲烷排放及其高度的时空异质性一个重要原因。

3.2 好氧MOB群落时空变化的影响因素

湖滨湿地具有各种不同水文条件,沉积物质量,植物群落,CH4氧化率和好氧MOB群落。然而,主导湖滨湿地好氧MOB群落分布的因素仍不清楚。本研究发现草海湖滨湿地从宽敞水域至湖岸随着水位降低type I群落向type II演替,这与湖滨湿地高度异质环境条件密切相关。

水文条件是驱动湖滨湿地好氧MOB群落空间分布的根本动力。水深梯度一方面可以直接影响好氧MOB群落分布。水深梯度控制了氧和CH4的可利用性,进而影响好氧MOB群落组成及活性空间分布[20]。长期积水的样点有利于CH4的产生,从而增加了底物的利用率并维持好氧MOB活性。因此,长期积水的样点形成较高的CH4氧化速率,较高的I型好氧MOB物种多样性和丰富度。此外,水深梯度还可以改变沉积物的理化,进而间接的影响着好氧MOB群落。土壤理化特性如pH值等对土壤好氧MOB群落分布具有重要的调控作用。本研究中从宽敞水域至湖岸随着水位降低沉积物pH值逐渐增大。有证据表明,高pH值有利于一般细菌物种的丰富性和CH4的氧化潜力[37]。本研究中沉积物pH在长期积水的样点最低,可能对好氧MOB群落分布产生了影响。沉积物中的氮对好氧MOB群落也有重要影响。水深梯度还可通过调控植物群落的分布来影响着好氧MOB群落的分布。地上植被对地下微生物多样性具有重要影响。淹水湿地植物通过向根际传输氧而对好氧MOB群落产生特殊影响。草海湖滨湿地植被分布受到水位严格控制,从宽敞水域至偶尔积水区,植被从沉水-挺水-湿生-中生演替,呈明显的带状性,植被的这种变化在草海湖滨湿地好氧MOB群落时空分布动态中可能起到了重要的调控作用。

4 结论

本研究发现云贵高原草海湖滨湿地好氧MOB群落在数量和组成上表现出巨大的时空变化。草海湿地好氧MOB属于变形菌门(proteobacteria),Ⅰ型和Ⅱ型都有分布,沿着水位降低Ⅰ型好氧MOB数量逐渐降低,而Ⅱ型好氧MOB数量逐渐增加,不同水位梯度下主导甲烷氧化的菌群可能不同。水文条件是决定湖滨湿地好氧MOB群落时空异质性重要因素,其直接或通过调控沉积物中理化和植物群落来影响好氧MOB群落的时空分布。下一步还需深入研究湖滨湿地中I型和Ⅱ型好氧MOB群落在甲烷氧化中的作用,并明确沉积物pH及植物群落对草海湖滨湿地好氧MOB群落分布的调控机制。