利用生物信息学分析圆锥角膜差异表达基因及蛋白相互作用的研究

曹瑾，郝静芳，田川，童路遥，张红葵，杨路，许素玲

圆锥角膜（KC）是一种以角膜扩张、中央区角膜基质变薄、呈圆锥形突起及高度不规则近视散光为特征的角膜扩张性疾病[1]。这种疾病受遗传、环境及种族等因素影响，患病率在1/2 000～1/375[2-4]。早期KC患者可通过框架眼镜和配戴角膜接触镜矫正视力，晚期患者只能通过手术如角膜交联术、角膜移植术等才能恢复视力[5]。因此，KC发病机制的研究对早期诊断和及时治疗具有重要意义。本研究利用生物信息学方法筛选并分析KC组织与正常角膜组织进行差异表达基因，以期阐明KC发生发展过程中的分子机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 数据获取 从GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中下载RNA-Seq数据集（GSE77938），该数据集基于GPL18460共有50个样本，其中包括正常角膜组织、KC组织样本各25例。

1.2 数据处理及差异表达基因筛选将GSE77938的RNAseq测序数据进行标准化和归一化处理后，利用R语言limma包分析差异表达基因，筛选符合条件的差异表达基因（DEGs），并绘制基因表达火山图，DEGs的筛选条件为|log FC|＞1.5且adjP value＜0.05。

1.3 差异表达基因富集分析 通过R语言的Cluster Profiler包对筛选出的DEGs进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，P＜0.05为富集的筛选阈值。

1.4 PPI网络建立与核心基因筛选 将所有DEGs导入STRING网站（https://string-db.org/），评估蛋白质之间的功能相互作用。应用Cytoscape对PPI网络进行可视化，进而筛选核心基因。

2 结果

2.1 差异表达基因 对KC及正常角膜组织转录组数据进行预处理，并通过R软件筛选得到394个差异表达基因。与正常组织相比，KC组织中有54个基因上调，340个基因下调。见图1。其中前10个上调基因分别是KLHL14、COL21A1、CTD-2008P7.9、BTBD16、SCN3A、SH3GL3、RP11-255H23.2、CYP26A1、CD36、RNA5SP487。前10个下调基因分别是CDH11、PTPRG、PDPN、PRICKLE1、CYP24A1、PRSS23、PLOD2、C1S、HLA-DPA1、C1R。

图1 差异表达基因火山图

2.2 GO富集分析 主要分为细胞组成、分子功能及生物学过程等。在细胞组成中，DEGs主要富集在细胞外基质、细胞外基质胶原、主要组织相容性复合体等；在分子功能中，主要富集在细胞外基质结构组分、提供抗拉强度的细胞外基质结构组分、血小板源生长因子结合等；在生物学过程中，主要富集在细胞外结构组织、细胞外基质组织、干扰素反应等。见图2。

图2 差异表达基因GO和KEGG部分分析结果

2.3 KEGG信号通路分析 差异基因主要富集在金黄色葡萄球菌通路、利什曼通路、类风湿关节炎通路，P值最小的前10项富集信号通路见图2。

2.4 构建PPI网络及筛选关键基因 通过STRING网站构建DEGs的蛋白互作关系网络，将结果导入Cytoscape中进行可视化分析，筛选分值最高的10个差异基因为核心基因，分别为HLA-DRA、HLA-C、HLA-DRB5、HLA-F、HLADQB1、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLAB、HLA-DPA1、HLA-DQA1（图3）。

图3 PPI分析后使用Cytoscape筛选分值最高的10个差异基因

3 讨论

KC是一种常见的非炎症性的角膜扩张性疾病，以中央角膜变薄、角膜瘢痕形成、角膜突出和不规则近视散光为特征，可导致明显的视力损害。研究显示KC与胶原发育障碍、内分泌与细胞代谢紊乱、免疫缺陷等相关，它的发病机制与遗传和环境有关[6]。

本研究通过对KC的RNA-Seq数据集的差异分析，获得394个差异基因，其中54个上调基因，340个下调基因。GO富集分析表明差异基因主要参与细胞外基质、胶原等细胞组分，此外还参与细胞外结构组织、细胞外基质组织等生物进程密切相关。细胞外基质是角膜的主要结构成分，赋予角膜特殊的生理功能[7]。在KC中，参与细胞外基质合成的基因异常，引起角膜细胞与基质的黏附作用减弱，连接间质的胶原纤维及其他细胞外基质功能降低，阻碍其与角膜基质胶原结合，进而影响正常角膜结构，导致角膜的稳固性下降，这可能是角膜圆锥状突起形成的主要原因之一[8]。

本研究发现，CDH11在KC中表达明显降低。有研究表明CDH11通过-catenin调节Wnt信号通路[9]。Wnt信号传导通路在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要的调节作用，与角膜疾病、视网膜病变等病理过程相关[10-11]。而有关CDH11在KC中发生、发展的分子机制有待进一步研究。KEGG分析结果显示差异基因主要参与金黄色葡萄球菌通路、利什曼通路、类风湿关节炎等信号通路，3条通路均涉及T细胞受体信号调控。这提示T细胞受体信号调控过程对KC生物学行为的影响有利于理解其免疫学过程，为基础及临床研究发掘出新的更有针对性的免疫疗法提供参考。为了进一步研究差异基因对KC的影响，对差异基因进行PPI构建及筛选后获得HLA-DRA、HLA-C、HLA-DRB5、HLAF、HLA-DQB1、HLA-DQA2、HLADRB1、HLA-B、HLA-DPA1、HLADQA1等核心基因，揭示人白细胞抗原可能是诊断KC的新型生物标志物。

综上所述，细胞外基质、T细胞受体信号调控等在KC发病过程中发挥重要的作用，本课题组将采用细胞模型对参与基因进一步深入研究。