酱油变质微生物因素及乳酸菌在防腐中的应用

吴浪涛，房 峻，吴 新，李兆雯，王晓珂，方 芳*

（1.江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 未来食品科学中心，江苏 无锡 214122；3.珠海天禾食品有限公司，广东 珠海 519090）

酱油是以大豆或豆粕、小麦或麸皮为原料，通过微生物发酵成的液体调味品。酱油味道鲜美，含有氨基酸、有机酸、醇类、酯类、醛类等多种呈味和风味物质。中国酱油一般采用低盐固态或高盐稀态发酵工艺，其生产流程包括：原料蒸煮、种曲培养、成曲制备、盐水发酵、淋油或压榨[1]。酱油发酵是包括霉菌、细菌、酵母在内的多菌种参与的混菌发酵过程。生产酱油的原料中含有丰富的营养物质，能够为微生物生长提供良好的条件。因此，酱油在生产和贮存过程中易出现因微生物污染引起的“生花”、变馊、胀袋、沉淀、浑浊、变酸等问题[2]。圆盘制曲和罐内控温发酵工艺的普及，对减少酱油生产过程中杂菌和腐败菌的污染起到了良好的作用。然而酱油发酵过程不是全封闭的纯菌种发酵过程，固态原料蒸煮时也可能存在灭菌的死角。为了保证发酵进程的顺利和成品的质量，目前，普遍采用生产工艺优化和在成品中添加化学防腐剂等防止腐败微生物污染的防治手段。生产工艺优化不能完全解决杂菌污染，对生产条件如厂房卫生条件和设备配置也有一定的要求。添加化学防腐剂不符合高端、绿色和健康食品的理念。因此，酱油的生物防腐工艺和措施受到研究者的广泛关注。乳酸菌是一类参与许多食品发酵的重要微生物，它们不仅对食品风味和营养的形成有积极贡献，还可合成许多具有抑菌性能的代谢产物，如有机酸、蛋白肽类物质、过氧化氢等。将乳酸菌或其抗菌代谢产物用于酱油的生物防腐具有良好的应用潜力和重要的研究意义。

1 微生物引起的酱油变质

与酱油变质有关的微生物包括耐热或耐盐的革兰氏阳性细菌、霉菌和酵母。芽孢杆菌（Bacillus）和酵母菌是最常见的引起酱油变质的污染菌。引起酱油沉淀和浑浊的微生物主要包括芽孢杆菌、镰刀菌和霉菌；导致酱油出现胀袋、产气的微生物则包括芽孢杆菌、乳杆菌（Lactobacillus）、假丝酵母（Candida）和白地霉（Geotrichum candidum）；酱油变馊和“生花”则主要与酵母菌有关（见图1）。

图1 引起酱油变质的微生物Fig.1 Microorganisms causing spoilage in soy sauce

1.1 酱油“生花”与变馊

在酱油生产过程中，空气、发酵容器、生产工具、原料等中的耐盐酵母容易混入其中并开始繁殖。酵母菌一方面能够产生醇、酯等多种风味物质形成特殊香气，是酱油酿造中重要的具有产香功能的微生物；另一方面，有些酵母菌会使酱油表面长出白膜引起酱油“生花”、产生氨臭味引起酱油变馊等危害。如产醭酵母能够在酱油表面生成灰白色粉状皮膜，并且分解酱油中的物质成分产生臭味。毕赤酵母（Pichia）、球拟酵母（Torulopsis）和鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是常见的产醭酵母，能够在酱油表面形成白膜[3]。研究证实，酱醅里的白点与产膜性鲁氏接合酵母过度繁殖有关。产膜性鲁氏接合酵母在高渗透压环境下高效表达编码疏水蛋白的基因FLO11，在细胞表面积累糖蛋白，增加酵母疏水性，从而聚集在酱醅表面形成白点[4]。引起酱油变馊的杂菌包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等。酱油中污染了这些菌不仅会使酱油达不到食品卫生要求，还产生令人不愉快的氨臭味，严重影响酱油的食用安全和品质。此外，酱油中存在的杂菌还能利用葡萄糖进行厌氧发酵生成2,3-丁二醇并进一步转化为双乙酰[5]，当酱油中双乙酰含量过高时表现为馊味，严重影响酱油的品质和风味。

1.2 酱油产气与胀袋

酱油产气胀袋（罐）是常见的一种酱油腐败现象。酱油产气胀袋的机理复杂，其原因主要有三类：物理因素、化学因素和生物因素。物理因素常指夏季高温时空气发生热胀冷缩，导致酱油胀袋。化学因素一般是酸与马口铁的铁锈作用产生气体，对瓶装和袋装酱油影响较小。生物因素是酱油产气的主要原因，空气、原料及产品中含有的微生物以及因灭菌不彻底留下的微生物都有可能继续发酵酱油产生气体。能够引起酱油胀袋的细菌主要有芽孢杆菌、乳酸菌、梭菌等。对酱油的生产和包装过程中的产气微生物情况研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其亚种（Bacillus subtilissubsp.natto）和破布子乳杆菌（Lactobacillus pobuzihii）含量较多时对酱油的胀袋、胀罐等有很大影响[6]。此外，巨大芽孢杆菌不止会使酱油胀袋，还会快速分解明胶等大分子物质，容易造成酱油中的风味物质降解严重破坏酱油的风味[7]。能够引起酱油胀袋的真菌包括菌膜假丝酵母（Candida pelliculosa）和白地霉（Geotrichum candidum）。这两类菌能耐受较高的渗透压（15%NaCl或80%葡萄糖），在pH值为5～6生长状态良好，它们的存在对酱油的品质有较大的不良影响[8]。

1.3 酱油沉淀与浑浊

酱油出现沉淀或浑浊，如果不是污染了腐败微生物并不影响其食用安全，但却降低了酱油的品质。因此，保证生酱油加热不产生沉淀和浑浊以及成品酱油的澄清透明是酱油生产过程控制的重点。引起酱油沉淀和浑浊的因素主要包括原料、蒸煮工艺或发酵工艺参数的改变、浸淋工序不合理、制曲的条件差、成曲酶活力低、杂菌污染、灭菌不彻底等。其中杂菌污染是使酱油发生沉淀或浑浊的一个重要的因素。制曲时由于曲料营养丰富容易使一些厌氧菌大量繁殖，通过浸淋和灭菌后仍滞留在成品当中。此外，细菌菌体的表面张力大，也容易吸附酱油中的一些大分子物质形成肉眼可见的沉淀物。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）产生的胞外多糖进入到酱油中会形成黏液多糖，进而使酱油产生絮状沉淀。对酱油一次沉淀形成机制的研究发现，酱油原油在60 ℃时会形成促沉淀因子L-谷氨酸-5-丁酯，促进蛋白质的絮凝沉淀[9]。曾新安等[10]在对酱油的原沉淀、一级沉淀和二级沉淀的成分进行分析后发现，蛋白质沉淀是酱油沉淀的主要原因。但目前关于酱油各级沉淀形成机制的研究尚不完全清楚，酱油污染微生物的代谢产物与酱油沉淀的关系也有待开展深入研究。

2 酱油微生物污染的防治

2.1 工艺优化防止酱油腐败

酱油腐败变质主要与微生物有关，因此防止酱油腐败的关键在于去除杂菌的污染。为了避免酱油出现“生花”、变馊、胀袋、沉淀、浑浊等问题，除了可以通过建立无菌的过滤车间、酱油高温瞬时灭菌、严格对设备灭菌、保持场地的清洁卫生来实现[3-4]。超声波保鲜、紫外线保鲜、电离辐射保鲜技术也常用于酱油保鲜，超声波灭菌速度快、且无外来添加物、对人体无害，但灭菌不彻底，常与其他灭菌手段协同灭菌，高献礼等[11]则应用超声协同热杀菌技术使酱油在无外加防腐剂、密封的情况下保质期大于180 d。紫外线灭菌对细菌、酵母、霉菌等都有很好的杀灭效果，用紫外线能够杀灭酱油菌落总数的85%，但该灭菌手段会使高蛋白、高脂肪食物产生轻度不良风味[12]。电离辐射对腐败细菌同样有很好的杀灭效果，戴智华[13]用90万rad的γ射线辐射灭菌酱油，能使酱油灭菌率在96%以上，且对酱油总酸、氨基酸态氮及感官指标几乎没有影响。但酱油中的酵母和霉菌对该技术有一定的抗性所以也存在一定局限性。

此外限制氧气对酱醅产生白点有一定的控制作用，所以可在贮油罐上口加盖并需注意间歇通气来防止酱油“生花”。为了防止酱油产气、胀袋，可在酱油灌装前进行真空脱气处理，并将灌装管深入到容器底部，减少气体的产生。对于减少酱油发生沉淀的工艺优化措施主要有：在原料的处理方面选择适合的原料和合适的粉碎粒度大小；在蒸煮过程中确定合适的蒸煮加水量、润水时间、水温及蒸煮压力；提高成曲质量并且在发酵过程中确定合适的发酵温度、酱醪pH值、盐水浓度；去除酱油的二次沉淀可选择添加蛋白酶制剂、澄清剂或者利用硅藻土过滤、膜过滤来实现[14]。

2.2 防腐剂用于防止酱油变质

在酱油中添加防腐剂也是防止酱油的腐败的有效措施，比工艺优化更高效、经济和方便。可在酱油中添加的防腐剂包括化学防腐剂和天然防腐剂。化学防腐剂包括苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、双乙酸钠、对羟基苯甲酸酯类（尼泊金酯）和脱氢醋酸钠等[15]。苯甲酸及其钠盐是应用最为广泛的食品用化学防腐剂，其在偏酸性环境下对细菌的抑制力较强，对酵母和霉菌的抑制力较弱，防腐适宜pH值为2.5～4.0，在酱油中的使用限量为1.0 mg/L。山梨酸（钾）能有效地抑制霉菌、酵母菌和好气性细菌的活性，还能抑制肉毒杆菌（Clostridium botulinum）、葡萄球菌（Staphylococcus）、沙门氏菌（Salmonella）等有害微生物的生长和繁殖，防腐适宜pH值在5.5以下，在酱油中的添加比例为0.01%。对羟基苯甲酸酯类对霉菌及酵母的作用较强，对细菌尤其是革兰氏阴性杆菌和乳酸菌的抑制作用较弱，其防腐适宜pH值为4～8，在酱油中的最大使用量为0.3 g/kg。化学防腐剂的抑菌谱与抑菌强度存在一定的差异，所以将各类化学防腐剂联合起来使用能够达到更好的防腐效果。例如，将苯甲酸钠和山梨酸钾按照1∶1的质量比配成复合防腐液，当温度为25 ℃时，总质量浓度只需0.4 mg/kg即可达到防腐效果[16]。在酱油中添加山梨酸和对羟基苯甲酸的混合物，对霉菌、酵母菌、细菌有更好的抑制作用[17]。虽然化学防腐剂能够在很大程度上满足人们对防腐的要求，但是当这些化学防腐剂摄入过量或者长期摄入的话对人体可能有一定的毒副作用。因此研究者考察了一些天然植物提取物的抑菌作用。在对118种中草药对酱油腐败菌毕赤氏酵母的抑制研究发现，乌梅、丁香和石榴皮对酱油都有防腐效果。其中乌梅的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）最小，分别是31.0 g/L和62.5 g/L[18]。洋葱汁、甘草、迷迭香等物质的抑菌性在酱油中也有很好的应用[19-20]。但目前植物提取物存在提取方法各异、分离水平低、应用成本高且无法确定有效抑菌成分及其抑菌机理等缺点，所以限制了其应用的快速发展。

3 乳酸菌在酱油防腐中的应用

化学防腐剂用于食品防腐存在一定的安全问题，而植物天然提取物防腐剂存在提取成本高、分离水平低等问题。因此微生物防治受到研究者们的广泛关注，许多微生物都可以合成抑制其他微生物生长的抑菌物质。目前，通过微生物培养、产物提取和分离已成功获得了纳他霉素、乳酸链球菌素、罗氏菌素、苯乳酸、乳酸、柠檬酸等多种具有抑制和杀灭食品腐败菌的微生物防腐剂[21]。乳酸菌是一类革兰氏阳性、不产生孢子、耐酸且产乳酸的兼性厌氧细菌。它们中的大多数菌是食品安全菌，并且乳酸所产的细菌素、有机酸等代谢产物具有多种腐败细菌和部分真菌的特性，在防治酱油腐败具有良好的应用效果和前景。乳酸菌主要包括乳杆菌属、乳球菌属（Lactococcus）、气球菌属（Aerococcus）、足球菌属（Pediococcus）、链球菌属（Streptococcus）等多个菌属[22]。乳酸菌在酱油的发酵过程中不仅能通过产生包括有机酸、氨基酸在内的多种风味物质而参与发酵，还能够合成多种抑菌物质来抑制如革兰氏阴性菌和真菌食品腐败菌的生长（见图2）。

图2 乳酸菌抗菌代谢产物及其对酱油中腐败菌的抑制Fig.2 Antimicrobial substances synthesized by lactic acid bacteria and their inhibition on spoilages organisms from soy sauce

因此，乳酸菌及其代谢产物可被认为是天然的绿色防腐剂[23]。如在酱醪发酵前期添加1×106CFU/g的嗜盐片球菌（Pediococcus halophilus）到酱醪中，能减少89.12%沉淀生成量，延迟发酵酱油二次沉淀的产生时间（15 d）且对酱油风味影响较小[24]。此外乳酸菌还能合成多种抗菌化合物如有机酸、生物活性抗菌肽、脂肪酸、羧酸、细菌素、过氧化氢、酚类等[25]。正是由于这些抑菌物质的作用，赋予了乳酸菌广泛的抗菌效果，它们被证明是最有潜力的生物防腐剂。

3.1 有机酸防腐

有机酸是微生物利用碳水化合物发酵产生的代谢产物之一。微生物合成的有机酸包括乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、苯乳酸、柠檬酸、苹果酸等。通常微生物细胞在环境pH接近中性时才能保持其内部的化学平衡，而乳酸菌可以通过产生有机酸来影响外界环境的pH值。外界环境物质组成和pH值改变时，细胞膜的结构单位如蛋白质、磷脂等也随之发生变化。这些改变会影响细胞膜的通透性，导致细胞内代谢物的渗漏[26]。乳酸是乳酸菌合成的主要有机酸，它不仅可以被用作各种加工食品中的酸化剂、pH缓冲剂，也是有效的腐败微生物抑制剂。乳酸不仅对大肠杆菌（Escherichia coli）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella）等都有不同程度的抑制作用，还能够增加酱油的口感并通过降低酱醪的pH值来有效抑制可引起酱油变质、胀袋的巨大芽孢杆菌生长。乙酸对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌都有一定的抑制作用。微生物对乙酸的敏感性取决于它们的细胞形态和结构特性。如与革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌相比，革兰氏阴性菌细胞壁较为脆弱，它们在pH值为6时生长即受到抑制；黑曲霉则在乙酸pH＜4.1才能被抑制，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）要在乙酸pH＜3.9才能被抑制[27]。研究表明添加0.3%乙酸钠和乳酸能有效防止酱油的产气胀袋[28]。在面对不同杂菌时，不同有机酸表现出来的抑菌强度存在一定差异。在泰利普氏酱油培养基中柠檬酸可使大肠杆菌的数量减少6.3个数量级，且其抗菌性能强于乙酸和乳酸。在实际的应用过程中常将各类有机酸结合起来运用以达到更好的抑菌效果。在酱油中添加0.15%～0.60%的复合有机酸（以质量比为3∶2∶2∶2的乙酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸）能够有效阻止产膜酵母的的生长防止酱油生花[29]。乳酸菌合成的苯乳酸作为一种新型高效生物防腐剂，能够破坏杂菌细胞膜的通透性和完整性，其对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和腐败真菌都有一定的抑制作用，具有有效的广谱抗菌活性。此外，它具有溶解性高、稳定性强等特点，且对人和动物无毒无害，其潜在的防腐功能有望开发并运用在酱油腐败的防治中[30-31]。

3.2 细菌素的抑菌作用

肽类物质是乳酸菌合成的抑菌物质之一，也称为细菌素。通过分析它们是否对蛋白酶处理敏感可以判断乳酸菌的抑菌物质是否为蛋白质或肽类[32]。细菌素是由某些细菌产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，能够对同种近缘菌株呈现狭窄的抑制谱。大多数乳酸菌所产的细菌素只抑制革兰氏阳性菌，如发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）产生的细菌素对乳杆菌、足球菌、明串球菌（Leuconostoc）、乳球菌等具有抑制作用。有些乳杆菌产的细菌素，如植物乳杆菌素SLG1不但可以抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，还可以抑制部分真菌[33]。目前，只有乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）产生的乳酸链球菌素（Nisin）已作为食品防腐剂应用在食品中。Nisin主要有2种抑菌机制：一种是作用在敏感细胞膜上，并且依赖于肽聚糖前体分子脂质Ⅱ的浓度，使细胞膜上形成孔洞，导致内容物泄漏，细胞自溶而死亡；另一种是隔离脂质Ⅱ来抑制细胞壁的合成，进而抑制菌的生长。乳酸链球菌素对大部分的革兰氏阳性菌，比如金黄色葡萄球菌、李斯特菌、微球菌，特别是芽孢杆菌、梭菌等具有明显的抑制作用[34-35]。已有研究证实，在酱醅中添加0.4%的乳酸乳球菌发酵液能够有效抑制酱醅中杂菌的生长，并保持酱醅62 d不变质[36]。在酱油中加入50～100 mg/L乳酸链球菌素，能够有效地抑杀酱油中的腐败细菌，实现酱油的防腐保鲜[37]。Nisin也常与其他抑菌物质协同抑菌应用在酱油防腐当中，如使用60 IU/g nisin，1%乳酸钠和0.02%单辛酸甘油酯组成的复合抑菌剂能有效抑制酱油中的酵母菌和霉菌，延长酱油的保质期[38]。罗氏菌素（reutrein）是罗伊氏乳杆菌产生的广谱抗菌物质，由乳杆菌在厌氧条件下发酵甘油产生。罗氏菌素是3-羟基丙醛单体、其环状二聚体及其水合物的混合物[39-41]。研究指出罗氏菌素的醛基能与巯基小分子和引起细胞氧化应激的蛋白质相互作用，进而能够使多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌的生长受到抑制[42]，其广泛的抑菌谱作为酱油防腐剂具有很好的潜力。

3.3 其他抑菌物质

乳酸菌代谢物质种类繁多，虽然对未知代谢产物的分离较为困难，但是随着不断改进抗菌化合物的分离和鉴定的方法可以发现更多新的乳酸菌产的抑菌物质。研究表明，乳酸菌产生的脂肪酸、酚类物质、过氧化氢、环二肽等都有很好的抑菌性能。乳酸菌产的脂肪酸能够有效的抑制某些芽孢杆菌和霉菌[43]，酚类物质对烟曲霉、寄生曲霉、镰刀菌和青霉均能产生不同程度的抑制作用[44]。过氧化氢能抑制嗜冷和致病微生物的生长[45]，环二肽对革兰氏阴性菌、霉菌和酵母的抑制作用也得到了很好的证明[46]。除此之外许多其他的抗菌代谢产物也相继被发现，例如分离自食淀粉乳杆菌培养液的两个具有抗真菌活性的核苷（胞嘧啶核苷和脱氧胞嘧啶核苷），已证实能够有效的抑制烟色曲霉菌[47]。二乙酰、13-羟基-9-十八烯酸、2-丙烯酯等这些乳酸菌的代谢产物也相继被报道具有抑菌活性和不同的抑菌谱[48-50]。乳酸菌在发酵过程中产生的每一种抑菌化合物对酱油的防腐都具有潜在的作用。它们都可能会对酱油中腐败微生物的生长繁殖造成额外的阻碍。

4 展望

酱油生产过程是多种微生物参与的混菌发酵过程。虽然酱醪体系中的优势真菌、乳酸菌和盐对杂菌和腐败菌有暂时的抑制作用，仍然存在酱油中含有腐败微生物导致在生产后期或货架期使酱油变质的风险。了解酱油生产过程可能受到污染的微生物种类，明析污染途径或工艺阶段，解析酱油腐败的微生物因素和其产生条件，寻找抑制腐败菌的食品级菌株或添加剂，对建立和开发防止酱油腐败的方法和措施具有重要意义。乳酸菌作为食品安全菌，它们是参与食品发酵的生产菌。乳酸菌可以合成多种类型的可抑制不同微生物的抑菌物质。通过广泛和深入开展其抑菌物质的分离及纯化方法、抑菌机理等方面的研究，将乳酸菌的抗菌代谢产物取代传统化学防腐剂添加到酱油当中能够抑制食源性致病菌、腐败菌，延长酱油的货架期；另一方面也可筛选具有良好抑菌效果且不影响酱油风味的乳酸菌，将其用于酱油的发酵生产以防止腐败微生物的污染。利用乳酸菌作为食品生物防腐剂将推进提升发酵调味品或发酵食品品质和安全性的技术研发与革新。