一个高烟碱转化烤烟株系的鉴定分析

田阳阳，轩贝贝，徐益群，杨继周，刘 魁，王正旭，王军伟，胡利伟

（1. 红塔烟草（集团）有限责任公司，云南 玉溪 653100；2. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南 郑州 450001）

烟草生物碱是烟草中重要的一类化学成分，它不仅是烟草重要的品质因素，而且是烟草商品的一种特质。烟草属中具有栽培价值的普通烟草（N.tabacum）和黄花烟草（N.rustica）均为烟碱积累型，通常情况下，烟碱占生物碱总量的90%～95%[1-2]。除烟碱外，烟草还含有其他次要生物碱，如降烟碱、新烟草碱、麦思明等[3-4]，这些次要生物碱也具有一定的生物活性，对烟草的品质和安全性产生影响[5]。在烟草栽培品种的群体中，一些烟株因为基因突变，具有降烟碱转化为降烟碱的能力，导致烟叶烟碱含量显著降低，降烟碱含量异常升高，这种由烟碱向降烟碱转化并达到一定程度的烟株成为转化株。

不同类型的烟叶其生物碱含量和组成差异较大，白肋烟和马里兰烟等晾烟存在较为突出的烟碱向降烟碱转化问题，其转化率和转化程度显著高于烤烟，其原因可能与调制方式和转化位点的数量和稳定性有关。白肋烟转化株外观特征不明显，烤烟转化株烤后烟表面出现色度较强的红色斑块，斑块上分布一些小颗粒状物体[6-9]。Jeffrey 和Tso 最早报道具有此类特征的烟叶，称其为“樱红”烟叶。Weybfew 等[2]的研究表明烤烟的高降烟碱含量与外观的“樱红”现象相连锁。对烟草中烟碱转化性状的遗传机制研究表明，“樱红”烟叶主要由基因突变形成，烟碱和去甲基烟碱之间的转化是由单一的显性基因控制[10]。

笔者通过连续3 a 的跟踪筛选，获得一个具有高烟碱转化的烤烟株系，其烤后烟叶能够稳定产生“樱红”现象。通过统计此株系在田间的农艺性状，检测其烟碱、降烟碱和麦思明等生物碱的含量，并采用SNP 技术对其和相关烟草品种的亲缘关系进行分析，明确其遗传背景，为后续进行转化株产生机制解析及高烟碱烟叶对卷烟质量影响评价提供材料和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017 年于玉溪市澄江县田间筛选获取转化株种子，2018—2020 年连续3a 在澄江县进行代际跟踪，对照品种选择玉溪烟区主栽烤烟品种K326 和云87，大田管理及采烤技术参照玉溪当地标准化生产措施进行。

1.2 试剂与仪器

DNA marker，Taq 聚 合 酶、DL2000 Marker、脱氧核苷酸混合物均购自于宝生物工程有限公司。荧光SSR 引物和Ezup 植物基因组 DNA 提取试剂盒和琼脂粉等购于上海生工生物工程有限公司。

3730XL DNA 分析仪（美国ABI 公司），超低温冰箱（美国Thermo Fisher 公司），NanoDrop 2000 分光光度计（美国Thermo Fisher 公司）、5420 型微量离心机（德国Eppendorf 公司）、Milli-Q 超纯水处理仪（美国Millipore 公司）、电子天平（德国赛多利斯公司）、PT100 型PCR 仪（美国伯乐公司）、TM3030 台式扫描电镜（日立高新技术公司）、 GelDoc EZ 型凝胶成像系统（美国伯乐公司）。

1.3 叶面显微观察

将烤后烟叶剪成1 cm×2 cm 的小块，然后采用双面胶粘至样品托表面。将TM3030 扫描电镜和真空泵开机，样品腔抽取真空1～2 min 至Evac 灯长亮即可进行下一步，点击Evac/Air 键放气，等Air 键灯停止闪烁，黄灯长亮时，拉开样品门，放置样品托，同时根据情况适当调整样品托高度，然后关闭腔门，按Evac/Air 键抽真空，接着按AUTO 键进行自动对焦，并进行拍照。

1.4 生物碱的检测

将烟叶于38 ℃烘干粉碎，称取0.3 g 烟末，将其分装入20 mL 螺口试管，使用移液器添加2.5 mL 氢氧化钠溶液（5%），室温放置15min，然后将20 mL三乙胺/甲基叔丁基醚溶液（0.01%）加入至管中，然后旋紧盖子后超声处理15 min，置于台式高速离心机6000 转/min 离心5min，从管中吸取有机相进行GC/MS 分析，检测各种生物碱的含量。

质谱条件：电离电压70 ev；溶剂延迟8 min；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；扫描方式选择离子模式（SIM）。气相色谱条件：色谱柱DB-35MS（30 m×0.25 mm i.d. ×0.25 μm d.f. ）；程序升温100 ℃（3 min）然后以8 ℃/min 的升温速度升温至260 ℃（10 min）；载气为氦气；柱流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；生物碱的检测：进样量1 µL，分流进样，分流比40 ∶1。

1.5 烟叶DNA 提取

烟叶基因组DNA 的提取采用Ezup 柱式植物基因组 DNA 提取试剂盒进行，具体操作如下：将0.1 g的新鲜叶片在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5 mL 的离心管中。加入600 µL 65℃预热的Buffer PCB和12 µL β-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃水浴25 min，间或混匀。加入600 µL 的氯仿，充分混匀，12 000 r/min 离心5 min。吸取上层水相至一个干净的1.5 mL 的离心管中。加入与上层水相等体积Buffer BD，颠倒混匀3 ～5 次，再加与上层水相等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2 min。10 000 r/min 离心1 min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，加入500 µL PW Solution，10 000 r/min 离心1 min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，加入500 µL Wash Solution，10 000 r/min 离心1 min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，12 000 r/min 离心2 min。取出吸附柱，放入一个新的1.5 mL 离心管中，在吸附膜中央加入50 µL TE Buffer，静置3 min，12 000 r/min 离心2 min，使用超微量分光光度计NanoDrop 2000 检测烟叶DNA浓度与纯度，将DNA 样品贮存于-20℃备用。

1.6 全基因组SNP 分析

利用 430 k Tobacco SNP array（美国 Affymetrix 公司）对TS01 和其他36 个烟草品种进行全基因组扫描，依托 国 家 烟 草 基 因 研 究 中 心 Gene Titan 芯 片（美国 Affymetrix 公司）平 台 进 行 样 本 DNA 的 SNP 分 型，具体操作参考张剑锋等[11]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 烟碱转化株TS01 农艺性状表现

在农艺性状方面，TS01 与K326 株型都表现为筒型，但叶面形态存在较大差异，TS01 叶面较平整且叶缘内扣，K326 叶面相对皱缩，TS01 叶耳较K326稍大（图1）。TS01 在烘烤后其外观特征表现为叶面出现色度较强的深红色或棕红色斑块，斑块上有明显小颗粒状物体，闻香较为突出（图2）。

图1 TS01 与K326 新鲜烟叶形态特征

图2 TS01 与K326 烤后烟叶形态特征

在田烟和地烟种植区域，TS01 的平均株高均低于K326，TS01 在田烟和地烟的株高分别为107.9 cm和98.8 cm，K326 分别为112.5 cm 和101.0 cm；TS01打顶后有效叶片数少于K326，田烟平均少1 片，地烟平均少2 片左右；TS01 节距略小于K326（表2）。

表2 TS01 与K326 的农艺性状比较

2.2 烟碱转化株TS01 的表面微观特征

K326 和TS01 的显微扫描照片都能够清晰显示细胞的边界、气孔、纤毛等，前者细胞排列整齐平滑，纤毛凸起干瘪，而TS01 烟叶细胞皱缩严重，表面高低不平，个别区域变形严重，细胞边界清晰，中心有凸起感，色彩稍深，细胞边界色泽稍浅，细胞中心位置与细胞边缘色泽有较大差异，纤毛数量与K326 比并无明显差异，气孔及保卫细胞陷入叶面中（图3）。

图3 TS01 和K326 中部叶的显微扫描

2.3 烟碱转化株TS01 的生物碱含量

TS01 生物碱各组分含量与K326 和云烟87 存在非常大的差异，其中K326 和云烟87 的烟碱含量分别是总生物碱的97.40%和96.91%，而TS01 则只有6.26%。降烟碱占总生物碱的比值，TS01 是90.78%，K326 和云烟87 则为1.56%和1.72%。麦思明和N-甲酰基降烟碱在TS01 中含量也较高，占总生物碱比值分别为0.86%和0.11%，而K326 和云烟87 中麦思明占总生物碱的比值在0.03%左右，N-甲酰基降烟碱占总生物碱的比值在0.003%左右（图4）。假木贼碱、新烟草碱、烟碱烯等其他生物碱的含量TS01、云烟87 及K326 之间有一定差异，但是差异倍数较小。与K326 相比，TS01 中假木贼碱增加了1.77 倍，新烟草碱增加了1.82 倍，而烟碱烯减少了49.74%。与云烟87 相比，TS01 中假木贼碱增加了1.53 倍，新烟草碱增加了1.5 倍，而烟碱烯减少了48.11%。可的宁含量三者之间没有明显差异。TS01 株系的烟碱转化率都在93%以上，而云烟87 和K326 烟碱转化率在2%以下，说明TS01 是一个具有极高烟碱转化率的烤烟株系。

图4 TS01 与K326、云烟87 主要生物碱含量对比

2.4 TS01 的遗传背景分析

利用烟草高密度SNP 芯片技术对TS01 和其他36 个烟草品种进行全基因组扫描，结果见表3。其中与TS01 遗传距离在0.1 以下的有2 个品种：云烟85和毕纳1 号。 在0.1～0.2 的有12 个品种，包括K326、云烟116、NC55 等。在0.2～0.3 的有KRK26、龙江981、豫烟6 号、云烟105、云烟100 等5 个品种，在0.3 以上的有TI245、中烟100、NC89 等17 个品种。

表3 TS01 与其他36 个烟草品种的SNP 分析比较

3 小结与讨论

TS01 大田生长株型为筒形，叶面较平整，叶耳稍大。烤后烟叶红色朱砂斑，色度较强的深红色或棕红色斑块，斑块上有明显小颗粒状物体，闻香较为突出。TS01 烟碱转化率都达到了93%以上，其中降烟碱，麦思明，N-甲基降烟碱含量极高，烟碱含量显著降低，SNP 遗传进化分析表明其与云烟85、毕纳1号等亲缘关系较近，为后续进行烟碱转化株产生机理解析，以及研究高烟碱转化率烟叶对卷烟产品烟气特征的影响提供了稳定的研究材料和背景数据。

烟碱含量异常增高的突变株，烘烤后的烟叶呈现樱桃红色。这种烟叶一般高降烟碱含量与外观的“樱红”现象相连锁[12-14]，对烟草中烟碱转化性状的遗传机制研究表明，烟碱和去甲基烟碱之间的转化是由单一的显性基因控制[15-17]，遗传稳定性的研究表明，高转化性状较为稳定，而低转化性状易发生突变[18-20]。TS01 的株高比K326 稍低，但并无太大差异，说明烟碱和降烟碱等都为次生代谢物，并不严重影响烟株的生长等生理过程。

TS01 烤后烟叶烟碱含量显著降低，而降烟碱、麦思明、N-甲基降烟碱含量均明显提高，说明TS01中从烟碱到降烟碱、麦思明、N-甲基降烟碱的代谢通路的酶活较高，基因可能出现一定程度的正向突变。有研究表明，P450 家族基因CYP82E4v1和CYP82E5v2等基因参与了烟碱向降烟碱的转化[21-23]，CYP82E5v2在鲜叶中特异表达，CYP82ElO在根部特异表达，CYP82E4vl主要在衰老叶片中及幼苗和成株的茎中表达，在根中几乎不表达，是烟碱转化的关键基因，这些基因同源性较高。高表达CYP82E4v1的植株其烟碱转化率达到了97%以上，TS01 中烟碱转化率也在93%以上，至于CYP82E4v1是否也在TS01中出现了超高的表达，还需要进一步研究。

研究人员以白肋烟TN90 为材料的研究表明，随着烟株烟碱转化能力的提高和烟叶降烟碱含量的增加，叶片和主脉的麦思明含量呈线性增加。当烟碱转化率超过20%时，麦思明含量超过了假木贼碱的含量[24-26]。而TS01中麦思明含量也已经超过了假木贼碱，其含量的提高究竟是否由于高含量降烟碱而出现的变化，另外N-甲基降烟碱的含量增加是否也是因为这个原因，还需要更多的试验进行验证。通过SNP 研究了TS01 与36 个烟草品种之间的关系，结果显示其与云烟85 亲缘关系最近，接着为毕纳1 号与K326，印证了其很大可能来自于云烟85，可能是云烟85 的自然突变株，完全确定则需要通过全基因组测序进行比对分析。